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Jun 07, 2024

Un atlas de especificidades de sustrato para el kinoma de serina/treonina humana

Nature volumen 613, páginas 759–766 (2023)Cite este artículo 67k Accesos 29 Citas 433 Detalles de Altmetric Metrics Este artículo ha sido actualizado La fosforilación de proteínas es una de las más extendidas

Nature volumen 613, páginas 759–766 (2023)Cite este artículo

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29 citas

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Detalles de métricas

Este artículo ha sido actualizado

La fosforilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más extendidas en biología1,2. Gracias a los avances en la fosfoproteómica basada en espectrometría de masas, hasta ahora se han identificado 90.000 sitios de fosforilación de serina y treonina, y varios miles se han asociado con enfermedades humanas y procesos biológicos3,4. Para la gran mayoría de los eventos de fosforilación, aún no se sabe cuál de las más de 300 proteínas serina/treonina (Ser/Thr) quinasas codificadas en el genoma humano es la responsable3. Aquí utilizamos bibliotecas de péptidos sintéticos para perfilar la especificidad de la secuencia del sustrato de 303 Ser/Thr quinasas, que comprenden más del 84% de las que se prevé que sean activas en humanos. Vista en su totalidad, la especificidad del sustrato del kinoma fue sustancialmente más diversa de lo esperado y fue impulsada en gran medida por la selectividad negativa. Utilizamos nuestro conjunto de datos de todo el kinoma para anotar e identificar computacionalmente las quinasas capaces de fosforilar cada sitio de fosforilación informado en el fosfoproteoma Ser/Thr humano. Para la pequeña minoría de fosfositos para los cuales se han informado previamente las supuestas proteínas quinasas involucradas, nuestras predicciones coincidieron excelentemente. Cuando se aplicó este enfoque para examinar la respuesta de señalización de tejidos y líneas celulares a hormonas, factores de crecimiento, inhibidores específicos y perturbaciones ambientales o genéticas, reveló conocimientos inesperados sobre la complejidad y compensación de las vías. En general, estos estudios revelan la especificidad de sustrato intrínseca del kinoma Ser/Thr humano, iluminan las respuestas de señalización celular y proporcionan un recurso para vincular los eventos de fosforilación con las vías biológicas.

La fosforilación de proteínas en los residuos de serina, treonina, tirosina e histidina controla casi todos los aspectos de la función celular eucariota1,2,5,6. La mala regulación de la señalización de la proteína quinasa comúnmente resulta en enfermedades humanas7. Descifrar las funciones celulares de cualquier proteína quinasa requiere el esclarecimiento de sus sustratos efectores posteriores. Sin embargo, la mayoría de las relaciones quinasa-sustrato que se han publicado hasta la fecha involucran un número relativamente pequeño de proteínas quinasas bien estudiadas, mientras que se han identificado pocos sustratos, si es que hay alguno, para la mayoría de las aproximadamente 300 proteínas quinasas Ser/Thr humanas. dentro del cinema humano8,9,10. Esta falta de conocimiento de las relaciones quinasa-sustrato limita la interpretación de grandes conjuntos de datos fosfoproteómicos basados ​​en espectrometría de masas (MS), que hasta la fecha han informado colectivamente más de 200.000 sitios de fosforilación de Ser y Thr en proteínas humanas3,4,11,12,13. Las quinasas específicas responsables de estos eventos de fosforilación se han informado en menos del 4% de estos sitios3, lo que limita sustancialmente la comprensión de las redes de fosforilación celular.

Se sabe generalmente que las quinasas Ser/Thr bien estudiadas reconocen residuos de aminoácidos específicos en múltiples posiciones que rodean el sitio de fosforilación14,15,16,17. Este motivo lineal corto, que es característico de una proteína quinasa determinada, garantiza la fidelidad en las vías de señalización que regulan la fosforilación en un residuo Ser o Thr determinado. El conocimiento de los motivos de reconocimiento de quinasas puede facilitar el descubrimiento de nuevos sustratos, por ejemplo, mediante el escaneo de datos fosfoproteómicos en busca de secuencias coincidentes. Sin embargo, hasta la fecha, los motivos de secuencia del sitio de fosforilación se conocen sólo para un subconjunto de la proteína humana Ser/Thr kinoma. Anteriormente hemos descrito métodos de detección de bibliotecas combinatorias de péptidos que permiten la determinación rápida de la especificidad de quinasas individuales basadas en la fosforilación de sustratos peptídicos18,19. Aquí aplicamos esos métodos para determinar experimentalmente la especificidad de sustrato óptima para la gran mayoría del kinoma Ser/Thr humano, caracterizamos la relación entre quinasas en función de sus motivos y utilizamos computacionalmente estos datos para identificar las proteínas quinasas que probablemente fosforilar cualquier sitio identificado mediante MS u otras técnicas. Finalmente, mostramos cómo se puede aplicar esta información para capturar cambios complejos en las vías de señalización en células y tejidos después de perturbaciones genéticas, farmacológicas, metabólicas y ambientales.

Los motivos de reconocimiento de sustrato en todo el kinoma Ser/Thr humano se determinaron realizando un análisis de matriz de péptidos de barrido posicional (PSPA). Utilizamos una biblioteca combinatoria de péptidos informada anteriormente que sustituye sistemáticamente cada uno de los 22 aminoácidos (20 aminoácidos naturales más Thr fosforilado y Tyr fosforilado) en nueve posiciones que rodean una posición central de fosfoaceptor que contiene cantidades equivalentes de Ser y Thr19 (Fig. 1a). . Utilizando preparaciones de quinasas recombinantes purificadas, obtuvimos con éxito motivos de sitios de fosforilación para 303 quinasas Ser/Thr, que cubren cada rama del árbol genealógico de las quinasas Ser/Thr humanas, así como una colección de proteínas quinasas atípicas (Fig. 1b, Fig. 1 complementaria). y Tablas complementarias 1 y 2). Faltaba un perfil de la gran mayoría de estas quinasas, incluidas 83 quinasas "oscuras" poco estudiadas8.

a, Flujo de trabajo experimental para el análisis de PSPA y resultados representativos. El esquema fue creado usando BioRender. Z denota posiciones fijas que contienen uno de los 20 aminoácidos naturales, o Thr fosforilada (pThr) o Tyr fosforilada (pTyr). X indica posiciones no fijadas que contienen mezclas aleatorias de todos los aminoácidos naturales excepto Ser, Thr y Cys. Las manchas más oscuras indican residuos preferidos. b, Dendrograma de la proteína quinama humana, destacando las quinasas Ser/Thr analizadas en este estudio.

Las matrices de puntuación de posición específica (PSSM) derivadas de datos cuantificados de PSPA se analizaron mediante agrupación jerárquica para comparar motivos de sustrato de quinasa en todo el kinoma (Fig. 2 y Tabla complementaria 2). Como se esperaba, las quinasas que comparten una identidad de secuencia sustancial mostraron un alto grado de similitud en sus motivos de sustrato óptimos. Sin embargo, encontramos muchos casos en los que la agrupación mediante PSSM no recapituló estrictamente las relaciones filogenéticas evolutivas entre quinasas inferidas de sus secuencias primarias (Fig. 2). En cambio, los miembros de la mayoría de los principales grupos de quinasas se distribuyeron a lo largo del dendrograma, lo que refleja numerosos ejemplos en los que las quinasas con baja identidad de secuencia general han convergido para fosforilar motivos de secuencia óptima similares. Por ejemplo, encontramos que varias quinasas relacionadas lejanamente (en las familias de receptores YANK, CK1 y 2, GRK y TGFβ) convergieron para fosforilar motivos de secuencia similares a pesar de sus ubicaciones dispares en el árbol del kinoma (Fig. 2 (grupo 3)) .

Agrupación jerárquica de 303 Ser/Thr quinasas en función de su selectividad por motivos de aminoácidos (PSSM). Los nombres de las quinasas están etiquetados con colores según sus relaciones filogenéticas (arriba a la derecha)2.

La inspección general de los motivos de secuencia asociados con varias ramas del dendrograma basado en motivos reveló que aproximadamente el 60% del kinoma Ser/Thr podría representarse mediante una simple asignación a una de las tres clases de motivos observadas previamente: selectividad para residuos básicos N terminales a la fosforilación sitio (grupo 1; Fig. 2); dirigido por un residuo de prolina en la posición +1 (grupo 2); o una preferencia general por residuos cargados negativamente (ácidos y fosforilados) en múltiples posiciones (grupo 3)15,20,21. En particular, más de la mitad de todos los sitios de fosforilación informados observados por MS podrían asignarse a una de estas tres firmas (Datos ampliados, figura 1). Sin embargo, cada una de estas clases de motivos podría subcategorizarse aún más en función de la selectividad tanto a favor como en contra de distintos conjuntos de residuos en otras posiciones, lo que refleja una diversidad considerable dentro de estos grupos (Datos ampliados, figuras 2 a 4). El 40% restante aproximadamente del kinoma Ser/Thr comprendía muchos grupos más pequeños que mostraban determinantes de secuencia únicos (Fig. 2; grupos 4-17). Por ejemplo, los motivos de las quinasas de la familia PIKK (ATM, ATR, DNA-PK y SMG1) se agruparon en un grupo que seleccionó principalmente un residuo Gln en la posición +1 (grupo 5), de acuerdo con estudios previos22,23. En particular, varios grupos mostraron motivos de consenso compartidos que no habían sido bien reconocidos anteriormente, como el grupo que incluye las quinasas IRAK, IRE, WNK, SNRK y RIP (grupo 13), de los cuales los motivos de sustrato contenían residuos básicos tanto N como C terminales. al sitio de fosforilación con selección dominante de residuos aromáticos en la posición +3. Como otro ejemplo, las quinasas LKB1, CAMKK, PINK1 y PBK (grupo 14) reconocieron principalmente residuos hidrófobos N terminales del sitio de fosforilación en combinación con selección de residuos promotores de turnos (Gly o Asn) en la posición +1. El modelado estructural de los complejos quinasa-péptido reveló características complementarias dentro de las hendiduras catalíticas de la quinasa que probablemente sean responsables del reconocimiento de estos motivos (Datos ampliados, Fig. 5a, b).

Una característica importante y menos generalmente reconocida que dominó la agrupación fue la fuerte selección negativa contra residuos cargados positiva o negativamente en distintas posiciones dentro de un motivo, lo que sugiere que el filtrado electrostático influye fuertemente en la selección del sustrato de quinasa en todo el kinoma24. Identificamos clases adicionales de aminoácidos, como residuos hidrófobos, que son seleccionados por una variedad de quinasas. Estas tendencias sugieren que evitar el sustrato tiene un papel fundamental a la hora de determinar las interacciones correctas entre quinasa y sustrato25,26.

Inesperadamente, observamos que muchas quinasas (129 de 303) seleccionaron un Thr fosforilado o un Tyr fosforilado como el aminoácido preferido en al menos una posición dentro del motivo (Figura complementaria 1; donde se asumió que la selectividad por Ser fosforilada era equivalente a Thr fosforilada). Además de las quinasas cuya dependencia del cebado con fosfo se conocía previamente (familias GSK3, CK1 y CK2; grupo 3), este fenómeno fue particularmente evidente para las quinasas de las familias GRK y YANK (Datos ampliados, figura 4), ambas de los cuales tienen residuos básicos complementarios dentro de sus dominios catalíticos (Datos ampliados, Fig. 5c, d). En particular, los miembros individuales de la familia GRK mostraron una selección única y específica para la ubicación del residuo Thr fosforilado o Tyr fosforilado dentro de sus péptidos sustrato. Las GRK son mejor conocidas por su papel en la desensibilización de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), mediante la cual la fosforilación multisitio induce la unión de las proteínas arrestina para inhibir la señalización27,28. Nuestros hallazgos sugieren que la capacidad de solo siete GRK para regular diferencialmente 800 GPCR distintos probablemente implica una interacción compleja entre el fosfocebado inicial específico de secuencia de GPCR por otras Ser/Thr y Tyr quinasas, seguido de un segundo nivel de especificidad resultante de GRK. -fosforilación dependiente y posterior reconocimiento por un pequeño número de β-arrestinas.

Las características de los motivos de reconocimiento de sustrato en todo el kinoma podrían racionalizarse estructuralmente sobre la base de la presencia de residuos que determinan la especificidad en posiciones particulares dentro del dominio catalítico de la quinasa29,30,31,32, lo que lleva a hallazgos tanto esperados como inesperados. Por ejemplo, encontramos que la mitad de las quinasas muestran cierto grado de selectividad para Ser o Thr como residuo fosfoaceptor (Datos ampliados, figuras 6 y 7). De acuerdo con nuestras observaciones publicadas anteriormente33, la preferencia del sitio fosfoaceptor Ser o Thr se correlacionaba fuertemente con la identidad del residuo 'DFG+1' (es decir, el residuo inmediatamente después del motivo canónico Asp-Phe-Gly dentro del bucle de activación de la quinasa) , con residuos voluminosos (Phe, Trp, Tyr) en esta posición en proteínas quinasas selectivas para Ser y residuos ramificados β (Val, Ile, Thr) en esta posición en quinasas selectivas para Thr. Sin embargo, para algunos residuos DFG+1, la selectividad de Ser frente a Thr dependió inesperadamente del contexto. Por ejemplo, se observó un residuo Leu en la posición DFG+1 en quinasas tanto selectivas para Ser como de especificidad dual, mientras que un residuo Ala DFG+1 resultó en una preferencia por la fosforilación de Thr en el contexto de algunas quinasas (por ejemplo, la proteína quinasa quinasa quinasas activadas por mitógenos (MAP3K)), pero una preferencia por la especificidad de Ser en otras (las quinasas IκB). Estas observaciones, notables sólo dentro del contexto del kinoma Ser/Thr completo, indican que residuos adicionales más allá de la posición DFG+1 previamente establecida pueden influir en la especificidad de Ser/Thr de una manera dependiente del contexto.

El conocimiento exhaustivo de la especificidad de la quinasa Ser/Thr humana tiene el potencial de "desorfanizar" la gran cantidad de sitios de fosforilación informados sin quinasa asociada. Para hacerlo, generamos una anotación de todo el kinoma del fosfoproteoma Ser/Thr humano, que comprende un conjunto previamente seleccionado de 82,735 sitios que se detectaron usando MS4 de alto rendimiento más 7,017 sitios adicionales que se identificaron usando solo métodos de bajo rendimiento3. Utilizando enfoques adaptados de investigaciones publicadas anteriormente, clasificamos computacionalmente estos 89,752 sitios frente a cada motivo de quinasa Ser/Thr34,35 (Fig. 3a y Tabla complementaria 3). En particular, aproximadamente el 99 % de estos sitios de fosforilación se clasificaron favorablemente para al menos una quinasa que perfilamos (es decir, el sitio obtuvo una puntuación en el 10 % superior de todos los sitios en el fosfoproteoma humano para esa quinasa). Estas anotaciones coincidieron fuertemente con los sitios para los cuales se identificaron previamente las proteínas quinasas involucradas. Para los sitios de fosforilación cuya quinasa aguas arriba ha sido previamente verificada por al menos tres informes independientes, que abarcan 969 sitios y más de un tercio del kinoma, nuestro enfoque basado en motivos arrojó un percentil medio del 95% (es decir, el sitio informado recibió una puntuación más alta que el 95% de todos los supuestos sitios de fosforilación en el fosfoproteoma para su quinasa establecida) (Datos ampliados, Fig. 8a). Además, cuando mapeamos los motivos de las 303 quinasas perfiladas en los sitios de fosforilación informados en la literatura, nuestro enfoque arrojó un percentil de quinasa mediano reportado del 92% (es decir, la quinasa reportada obtuvo una puntuación más favorable que el 92% de todas las quinasas perfiladas). en nuestro atlas para su sustrato establecido) (Datos ampliados, Fig. 9a). Estas clasificaciones mejoraron aún más cuando consideramos los pares quinasa-sustrato con un mayor número de informes anteriores (Datos ampliados, figuras 8 y 9), lo que sugiere que, en una gran mayoría de los casos, el contexto de secuencia lineal de los sitios de fosforilación contribuye sustancialmente a la relación quinasa-sustrato. relaciones.

a, Esquema del proceso de puntuación del sustrato4. b, Resultados de Ser15 en la glucógeno fosforilasa junto con PSSM y el logotipo del motivo del sustrato de su quinasa glucógeno fosforilasa quinasa establecida. c, Los resultados de Ser15 de p53 junto con su quinasa ATM establecida. d, Anotación del fosfoproteoma Ser y Thr humano mediante puntuaciones percentiles de 303 quinasas Ser/Thr realizadas como se muestra en a. Un total de 89,752 sitios de fosforilación que se identificaron utilizando enfoques de alto rendimiento4 y/o enfoques de bajo rendimiento3 se ordenaron a lo largo del eje x por su número de quinasas con puntuaciones percentiles superiores a 90. En el eje y, las puntuaciones percentiles de quinasa fueron ordenados por rango por separado para cada sitio y representados en el mapa de calor. Se resaltan ejemplos de relaciones quinasa-sustrato bien estudiadas (cuadrados amarillos). Recuadro: los sitios de fosforilación en el extremo izquierdo del gráfico obtuvieron puntuaciones favorables para muchas quinasas, mientras que los sitios en el extremo derecho obtuvieron puntuaciones favorables para menos quinasas.

En particular, las predicciones de motivos por sí solas identificaron con éxito numerosas relaciones quinasa-sustrato destacadamente estudiadas. Por ejemplo, las fosforilasa quinasas PHKG1 y PHKG2 emergieron como los dos primeros resultados (de 303 quinasas) para fosforilar Ser15 de la glucógeno fosforilasa (Fig. 3b). Este evento fosforregulador, el primero en ser descubierto36, abrió todo el campo de la transducción de señales dependiente de la fosforilación. La interacción quinasa-sustrato más citada reportada hasta la fecha es la fosforilación del supresor de tumores p53 en Ser15 por la quinasa ATM activada por daño al ADN, que se ubicó entre las quinasas de mayor rango asociadas con ese sitio (Fig. 3c). En particular, otras quinasas que fosforilan el mismo sitio (ATR, SMG1 y DNAPK) se ubicaron entre las cuatro quinasas más predichas3.

Nuestro enfoque también podría identificar correctamente las quinasas para eventos de fosforilación impulsados ​​por la colocalización del sustrato o interacciones de acoplamiento no catalíticas, para las cuales esperábamos una menor dependencia de los motivos del sitio de fosforilación de sus quinasas. Por ejemplo, identificamos correctamente tanto la fosforilación mitocondrial localizada de la piruvato deshidrogenasa por las piruvato deshidrogenasa quinasas (Datos extendidos, Fig. 10a) como la fosforilación impulsada por el acoplamiento de la MAP quinasa ERK por MEK37 (Datos extendidos, Fig. 10b). En particular, el sitio de fosforilación en ERK fue seleccionado por casi todas las proteínas quinasas humanas que perfilamos, excepto MEK, lo que explica cómo ERK puede ser regulado exclusivamente por MEK y al mismo tiempo evitar la fosforilación por parte del kinoma en general. Finalmente, nuestro enfoque podría separar subfamilias de quinasas con motivos similares y asignarlas correctamente a sus sustratos establecidos. Por ejemplo, podríamos distinguir entre las quinasas de la familia CDK que asumen funciones clásicas en la progresión del ciclo celular (es decir, CDK1, CDK2, CDK3, CDK4 y CDK6) y el subconjunto de CDK que gobiernan la transcripción genética (es decir, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, CDK13 y CDK19)38,39 (Datos ampliados Fig. 11).

La anotación funcional del fosfoproteoma humano nos permitió examinar las tendencias globales en las interacciones quinasa-sustrato. Descubrimos que la mayoría de los sitios de fosforilación podrían asignarse a una pequeña cantidad de supuestas quinasas (es decir, BRAF – MEK1, ATM – p53 y CDK4 – Rb; Fig. 3d y Tabla complementaria 3). Sin embargo, aproximadamente un tercio de todos los sitios carecían de características únicas de discriminación de secuencia negativa y, en cambio, coincidían bien con los motivos de fosforilación óptimos para un mayor número de quinasas21,40,41,42 (es decir, Ser119 de CREB, Ser9 de GSK3B y Thr1079 de LATS1 (Fig. 3d). Esto podría sugerir la importancia de otros factores determinantes de la quinasa (andamios, localización, etc.) para el reconocimiento adecuado del sustrato de la quinasa, o puede indicar que estos sitios de fosforilación específicos son puntos de convergencia para múltiples vías de señalización. Por ejemplo, la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB) está fosforilada canónicamente en Ser119 por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA); sin embargo, numerosos informes anteriores demuestran que una amplia gama de estímulos celulares y perturbaciones de fármacos inciden en la fosforilación de este sitio por no menos de diez quinasas distintas3. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la presencia de elementos de selectividad negativa que flanquean un supuesto sitio de fosforilación puede usarse para aislar un sustrato de una fosforilación inapropiada por docenas de quinasas relacionadas, mientras que la ausencia de dicha selectividad negativa puede permitir que las proteínas quinasas en distintas vías convergen hacia el mismo objetivo.

Las redes de señalización celular son complejas y dinámicas. La perturbación de las vías de señalización de las quinasas por manipulaciones genéticas, tratamiento con factores de crecimiento y ligandos, estrés ambiental o inhibidores de moléculas pequeñas remodela el fosfoproteoma a través de efectos tanto directos como indirectos como consecuencia de respuestas de señalización secundarias y/o efectos fuera del objetivo del tratamiento experimental43 . Debido a la naturaleza interconectada y dinámica de las redes de fosforilación, distinguir entre eventos de señalización iniciales y aquellos que resultan de la activación posterior de vías de señalización adicionales es un problema común y desafiante. Razonamos que las quinasas subyacentes a los eventos de fosforilación primaria y secundaria podrían revelarse mediante un análisis global basado en motivos de los cambios en el fosfoproteoma correspondiente. Para probar esta idea, utilizamos conjuntos de datos de MS disponibles públicamente de células recolectadas en ausencia o presencia de diversas perturbaciones y calificamos todos los sitios de fosforilación con nuestro atlas de motivos de quinasa Ser/Thr. Los motivos de quinasa que se enriquecieron o agotaron significativamente después del tratamiento experimental se representaron como gráficos de volcán de frecuencias de motivos y valores de P ajustados (Fig. 4a).

a, Flujo de trabajo del análisis de enriquecimiento de motivos de datos de fosfoproteómica. El esquema fue creado usando BioRender. b – g, resultados de conjuntos de datos publicados. b, Medio condicionado de células HepG2 después de la eliminación genética de FAM20C44. c, Miotubos cultivados después de 30 minutos de tratamiento con isoproterenol 2 μM45. d, células HeLa después de la detención mitótica mediante tratamiento durante 45 minutos con inhibidor de PLK1 BI 2536 0,1 μM (ref. 46). e, células A549 2 h después de la exposición a 6 Gy de radiación ionizante49. f, adipocitos 3T3-L1 después de la inanición sérica y luego 1 min y 60 min de tratamiento con insulina 100 nM54. g, células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón C57BL/6J después de 30 min y 4 h de tratamiento con 100 ng ml-1 de lipopolisacárido (LPS)55. Los enriquecimientos en b – g se determinaron mediante pruebas exactas unilaterales de Fisher y se corrigieron según múltiples hipótesis utilizando el método de Benjamini-Hochberg. Las versiones completamente comentadas de estos gráficos se presentan en la figura complementaria 2.

Utilizando este enfoque, encontramos que los motivos de secuencia correspondientes al objetivo más directo de una perturbación genética o química se encontraban entre los regulados más significativamente, como se ve, por ejemplo, para la eliminación genética de la caseína quinasa primordial secretada FAM20C (Fig. 4b). . Cuando se analizaron datos cuantitativos de fosfoproteómica de células HepG2 que carecen de FAM20C44 utilizando nuestro conjunto de datos de todo el kinoma, el motivo de reconocimiento de quinasa más regulado a la baja correspondió al de FAM20C. De manera similar, cuando se estimularon células de miotubos similares al músculo esquelético durante 30 minutos con isoproterenol45, los motivos de fosforilación más regulados correspondieron a múltiples isoformas de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), quinasas efectoras canónicas aguas abajo de los receptores adrenérgicos β1 y β2 (Fig. 4c). En particular, los motivos de PKA son muy similares a los de otras quinasas basófilas, pero pudimos identificar su enriquecimiento en este escenario. Además, nuestra colección completa de motivos del kinoma Ser/Thr aclaró eventos de señalización secundaria en un conjunto de datos de células HeLa detenidas en mitosis utilizando el inhibidor de PLK1 BI 2536 (Fig. 4d) 46; Aquí, además de observar una notable regulación a la baja de los sustratos que contienen el motivo PLK1 óptimo, también observamos una regulación positiva de los sustratos fosforilados por ATM y ATR. Este hallazgo concuerda con informes anteriores de que PLK1 puede suprimir la señalización del daño del ADN en las células mitóticas47,48.

Nuestro análisis basado en motivos también podría usarse para revelar eventos de señalización clave resultantes de intervenciones más complejas. Por ejemplo, examinamos datos fosfoproteómicos de células A549 tratadas con 6 Gy de radiación ionizante49 (Fig. 4e). Nuestro análisis reveló la regulación positiva y negativa de numerosas vías de señalización, incluida la regulación positiva de las quinasas canónicas implicadas en la respuesta al daño del ADN (ATM, ATR, DNA-PK) y la regulación negativa de las quinasas canónicas implicadas en la progresión del ciclo celular (CDK1, CDK2, CDK4). y CDK6), consistente con el arresto de G1/S y G2/M. Además, encontramos una regulación positiva y negativa de las quinasas que responden al daño del ADN menos apreciadas (MAPKAPK250,51, PLK352 y LRRK253).

La colección completa de motivos del kinoma Ser/Thr también permitió resolver la dinámica temporal de la señalización a partir de conjuntos de datos fosfoproteómicos resueltos en el tiempo. Por ejemplo, el análisis basado en motivos de datos fosfoproteómicos de adipocitos 3T3-L1 tratados con insulina54 reveló una rápida activación de la vía de señalización de la fosfoinositida 3-quinasa dentro de 1 minuto después de la estimulación con insulina seguida de la posterior activación de la vía MAPK, junto con una regulación negativa de AMP- proteínas quinasas activadas en 60 minutos (Fig. 4f). De manera similar, el análisis de datos fosfoproteómicos de células dendríticas estimuladas por lipopolisacáridos sugirió una marcada regulación positiva a los 30 minutos de un conjunto de quinasas activadas por estrés que incluyen las IKK, JNK y p38 MAPK, junto con la familia MAPKAPK de quinasas efectoras p38. Esto fue seguido dentro de 4 h por la posterior regulación positiva de las PIM quinasas y la supresión de las MAPK en paralelo con la regulación negativa de sus MAPK3K aguas arriba (MEKK1, MEKK2 y ZAK), lo que sugiere un circuito de retroalimentación negativa (Fig. 4g). Por lo tanto, los enfoques integrales basados ​​en motivos, cuando se aplican a experimentos de fosfoproteómica resueltos en el tiempo, pueden descifrar las distintas dinámicas temporales de diferentes grupos de quinasas.

Aquí presentamos el espectro completo de motivos de sustrato del kinoma de serina/treonina humana y proporcionamos un marco integral imparcial para explorar más a fondo sus funciones celulares. Globalmente, estos motivos son sustancialmente más diversos de lo esperado, lo que sugiere un repertorio de sustratos más amplio del kinoma. La agrupación jerárquica de este conjunto de datos reorganizó el kinoma en al menos 38 clases de motivos e introdujo varias características de motivos compartidos (Fig. 2 y Datos extendidos, Figs. 2-4).

Las quinasas Ser/Thr que perfilamos fueron, casi sin excepción, fuertemente discriminatorias contra características de motivos específicos. Estos hallazgos sugieren que la fidelidad en las vías de señalización de las quinasas se logra en gran medida mediante la presión selectiva sobre los sustratos para evitar la fosforilación por la mayoría de las quinasas irrelevantes, y que esto puede ocurrir ajustando las secuencias de aminoácidos que rodean los sitios de fosforilación para que no sean favorecidas por las quinasas no afines. . Como esta selección negativa contribuye sustancialmente al reconocimiento adecuado del sustrato, la identificación precisa de las relaciones quinasa-sustrato requiere un conocimiento exhaustivo de los motivos de fosforilación de la quinasa, no sólo para una quinasa individual de interés, sino también para todas las demás quinasas del kinoma humano que podrían competir por el mismo. la misma piscina de sustrato.

Cuando se utilizó este conjunto de datos de todo el kinoma para predecir las quinasas específicas que son responsables de la fosforilación del sustrato basándose únicamente en la secuencia de aminoácidos que rodea el sitio de fosforilación, los resultados fueron muy precisos para identificar las relaciones correctas entre quinasa y sustrato, incluso sin conocimiento de la especificidad del tejido. , efectos de andamiaje o localización subcelular. La inclusión de dicha información adicional probablemente mejorará aún más estos enfoques predictivos57,58. Una limitación del uso de matrices de péptidos de primer orden en estos experimentos es que no miden directamente las contribuciones de los contactos interposicionales dentro de los péptidos sustrato, lo que hemos demostrado previamente que puede afectar la selección de sustrato para algunas tirosina quinasas32, aunque menos para Ser/Thr. quinasas59. Además, no pudimos diferenciar entre la selección posicional de residuos Ser o Thr y la fosforilación directa de residuos vecinos (por ejemplo, péptidos que contienen más de un fosfoaceptor). Los enfoques de modelado estructural guiados por datos de motivos de sustrato de quinasa potencialmente descifrarán esta información adicional para mejorar aún más las predicciones60,61.

El examen de conjuntos de datos fosfoproteómicos de MS utilizando esta colección global de motivos arrojó posibles conocimientos biológicos y supuestos sustratos de quinasa (Fig. 4). Por ejemplo, en células sometidas a exposición a radiación ionizante (Fig. 4e), se predijo que ATM se dirigiría a 37 de los sitios de fosforilación que estaban regulados positivamente, la mayoría de los cuales nunca se han asociado como sustratos para ATM (Tabla complementaria 4). A medida que continúa avanzando la aplicación de la fosfoproteómica a muestras clínicas humanas y sistemas modelo de enfermedades, nuestro enfoque integral basado en motivos estará excepcionalmente equipado para desentrañar la señalización compleja que subyace a la progresión de las enfermedades humanas, los mecanismos de resistencia a los medicamentos contra el cáncer, las intervenciones dietéticas y otros aspectos fisiológicos importantes. procesos. En resumen, prevemos que esto proporcionará un recurso valioso para un amplio espectro de investigadores que estudian las vías de señalización en la biología y las enfermedades humanas.

Las células Expi293 (Thermo Fisher Scientific) y HEK293T (ATCC) se obtuvieron directamente de proveedores que realizan genotipado repetido en tándem corto para la autenticación de células humanas y se verificó que estaban libres de micoplasmas. Las células de insecto Sf9 se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific.

Para la expresión y purificación a partir de bacterias, las secuencias de ADN de las quinasas Ser/Thr humanas, las parejas de unión y las chaperonas que se enumeran a continuación se optimizaron con codones para la expresión en Escherichia coli utilizando el software de predicción GeneSmart (GenScript). Las secuencias de codificación optimizadas se sintetizaron como gBlocks (Integrated DNA Technologies) que llevan salientes de 16 pb en los extremos 5 'y 3' para facilitar la clonación por fusión (Clontech) en vectores de expresión pET (EMD Millipore).

Las construcciones pCDFDuet1 fueron las siguientes: HSP90AA1-His6 (longitud completa), denominada en lo sucesivo 'HSP90'; HSP90 sin etiquetar (longitud completa); His6-MO25a (longitud completa); Dominio N-terminal His6-ALPHAK3/ALPK1 (1–474); y His8-CCNC (longitud completa) en conjunto con MED12-His8(1–100); MEK5/MAP2K5 sin etiquetar (S311D, T315D; longitud completa); y CK2B sin etiquetar (longitud completa). Las construcciones de pET28a fueron las siguientes: His6-PDPK1 (longitud completa); His6-PRP4/PRPF4B(519–final); GST-CAMK1A (longitud completa); GST-CHAK2/TRPM6(1699–fin); His6-caMLCK/MYLK3(490–final); Su6-CAMKK1 (124–411); His6-ERK7/MAPK15 (longitud completa); His6-SUMO-ALPHAK3/ALPK1 CTD(959–final); MYO3A-His6(1–308); ERK5/MAPK7-His6(1–405); Su6-NIK/MAP3K14(327–673); y BMPR2-His6 (172–504). Las construcciones de pETDuet1 fueron las siguientes: His6-CDK8 (1–360, fusión con la cola C de CDK19 (360–extremo)), His6-CDK19 (longitud completa); Su6-AAK1(27–365); Su6-BICICLETA (37–345); CK2A1-His6 (longitud completa); CK2A2-His6(longitud completa); His10-MBP-MEKK1/MAP3K1(1174–final); His6-CLK1(128–final); Su8-PLK2(57–360); Su10-MAP3K15(631–922); Su6-SUMO-ASK1/MAP3K5(659–951); y His6-TAO2 (1–350). La construcción pACYDuet1 fue la siguiente: CDC37 sin etiquetar (longitud completa).

Para mejorar la expresión en células de líneas de mamíferos, las secuencias de ADN de His6-GST-SBK1 (longitud completa) y Flag-His6-WNK3 (1–434) se optimizaron para la expresión en Homo sapiens utilizando GeneSmart (GenScript) y se sintetizaron como gBlocks (Integrated DNA Technologies) que lleva salientes de 16 pb para facilitar la clonación por infusión en pCDNA3.4 digerido (Thermo Fisher Scientific).

Para generar una construcción de expresión en mamíferos para TAK1/MAP3K7, la secuencia codificante de esta quinasa (GE Healthcare Dharmacon, MHS6278-202756930) y su compañero de unión TAB1 (GE Healthcare Dharmacon, MHS6278-202760135) se amplificaron por PCR y se ligaron como una fusión. construya (TAK1 (1–303) -TAB1 (451–end)) en el vector de expresión de mamíferos pLenti-X mediante infusión.

Las construcciones de expresión compradas u obtenidas de otros laboratorios o de Addgene fueron las siguientes: las construcciones de expresión bacterianas para GST-VRK1 (longitud completa) y GST-VRK2 (longitud completa), en pGEX-4T, se recibieron como obsequio de P. Lazo62. La construcción de expresión bacteriana para CDKL5-His6(1–352) de ratón, en pET23a+, se recibió como regalo de S. Katayama63. Las construcciones de expresión bacteriana para His6-SUMO-PDHK1 (longitud completa), His6-SUMO-PDHK4 (longitud completa), pGroESL (GroEL/GroES) y MBP-BCKDK (longitud completa) se recibieron como obsequios de D. Chuang, S.- C. Tso y R. Wynn64,65. pProEx HTa-BRAF_16mut V600E(444–721) fue un regalo de M. Therrien en la Universidad de Montréal66. D. Cortez67 proporcionó construcciones de expresión de mamíferos para Flag-ATR (S1333A) y HA-ATRIP. Las construcciones de expresión bacteriana para DMPK1, CAMK1G, CAMK2G, PHKG2, CDKL1, GAK y lambda fosfatasa se adquirieron de Addgene (Addgene, 1000000094)68.

Las transformaciones se realizaron utilizando células BL21 Star (Thermo Fisher Scientific) a menos que se especifique lo contrario. Las concentraciones de antibióticos utilizados fueron las siguientes: carbenicilina (100 mg l-1), kanamicina (50 mg l-1), espectinomicina (25 mg l-1) y cloranfenicol (25 mg l-1 en etanol, preparado fresco). Las células transformadas se cultivaron en 1 l de Terrific Broth agitando a 190 rpm a 37 ° C hasta que la densidad óptica (λ = 600 nm) alcanzó 0,7–0,8, momento en el que se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión. Luego, las células se transfirieron a un agitador refrigerado y se agitaron a 220 rpm a 18 °C durante 16 a 20 h. Las células se centrifugaron a 6000 gy los sedimentos se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Todos los pasos para la purificación de proteínas se realizaron a 4 °C. Los sedimentos celulares se solubilizaron en tampón de lisis (descrito a continuación) y se lisaron mediante sonicación con sonda. El lisado se centrifugó a 20.000 g durante 1 h y el sobrenadante se combinó con resina de purificación por afinidad, níquel NTA (Qiagen) o glutatión Sefarosa (GE Health) que se había enjuagado en tampón base. La suspensión de perlas sobrenadante se agitó durante 30 min. La resina se lavó con 1 l de tampón base y se eluyó en 10 volúmenes de lecho de tampón de elución. La proteína eluida se concentró utilizando unidades de filtro ultracentrífugas (Amicon), complementadas con DTT 1 mM y 25% de glicerol, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Los buffers fueron los siguientes. Tampón de lisis estándar: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa libre de EDTA HALT (Life technologies), β-mercaptoetanol 5 mM y 1 a 3 g de lisozima (Sigma -Aldrich). Tampón de base estándar: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 % (se incluyó imidazol 50 mM para las purificaciones que involucran etiquetas de polihistidina). Tampón de lavado estándar: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 % (se incluyó imidazol 50 mM para las purificaciones que involucran etiquetas de polihistidina). Tampón de elución con etiqueta de polihistidina: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, imidazol 350 mM. Tampón de elución de etiqueta GST: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, glutatión 10 mM (el pH se ajustó después de la adición de glutatión).

CDK8 se copurificó con CCNC/MED12. CDK19 se copurificó con CCNC/MED12. CK2A1 y CK2A2 se copurificaron con CK2B. ERK5 se coexpresó con MEK5DD. Las quinasas BRAF y NIK se coexpresaron con el complejo HSP90-CDC37 sin etiquetar. Se copurificaron los dominios N- y C-terminales de ALPHAK3. DMPK1, CAMK1G, CAMK2G, PHKG2, CDKL1 y GAK se coexpresaron con lambda fosfatasa en células Rosetta 2 (Novagen). PDHK1, PDHK4 y BCKDK se coexpresaron con GroeL/GroeS y se purificaron con los siguientes tampones: tampón de lisis (fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5, L-arginina 10 mM, KCl 500 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, 0,2% Triton X-100, lisozima), tampón de lavado (fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5, arginina 10 mM, NaCl 500 mM, Triton X-100 al 0,1 %, MgCl2 2 mM) y tampón de elución (Tris 25 mM, pH 7,5, 120 mM). KCl, Tween-20 al 0,02%, arginina 50 mM, imidazol 350 mM para PDHK1 y PDHK4, maltosa 20 mM para BCKDK). BCKDK se purificó mediante su etiqueta MBP en resina de amilosa (NEB). CDKL5 se expresó en células BL21-codonplus (DE3) -RIL. KIS (de longitud completa) se purificó como se describió anteriormente69.

Se cultivaron células Expi293F (Thermo Fisher Scientific) en 500 ml de medio de expresión Expi293 (Thermo Fisher Scientific) en matraces giratorios de 2 l en una plataforma de agitación magnética a 100 rcf a 36,8 °C bajo 8% de CO2. Para la transfección, se diluyeron 500 μg de construcciones de expresión en medio de suero reducido Opti-MEM I (Thermo Fisher Scientific). El reactivo ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) se diluyó con Opti-MEM por separado y luego se combinó con ADN plasmídico diluido durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se transfirió la mezcla a las células (3 x 106 células por ml) y se agitó. Luego, 20 h después de la transfección, se agregaron a las células ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1 y Enhancer 2 (Thermo Fisher Scientific). Dos días después, las células se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C (3 días después de la transfección).

Todos los pasos para la purificación de proteínas se realizaron a 4 °C. Los sedimentos celulares se solubilizaron en tampón de lisis y se lisaron mediante homogeneización con Dounce (20 golpes). El lisado se centrifugó a 100.000 g durante 1 h y el sobrenadante se combinó con resina de purificación por afinidad, níquel NTA (Qiagen), glutatión sefarosa (GE Health) o gel de afinidad anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich) y se agitó durante 30 min. (perlas de níquel y glutatión) o 1 h (perlas anti-Flag). La resina se lavó con 1 l de tampón base y se eluyó en 10 volúmenes de lecho de tampón de elución. Para la elución de las proteínas marcadas con Flag, las perlas se sumergieron en tampón de elución (0,15 μg ml-1 3x péptido Flag (Sigma-Aldrich)) y se agitaron durante 1 h antes de la elución. La proteína eluida se concentró utilizando unidades de filtro ultracentrífugas (Amicon), complementadas con DTT 1 mM y 25% de glicerol, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Los buffers fueron los siguientes. Tampón de lisis estándar: Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 5 %, Triton X-100 al 1 %, β-mercaptoetanol 5 mM, inhibidores de proteasa HALT. Tampón base estándar: Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2%. Tampón de lavado estándar: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2%.

El SBK etiquetado con His6-GST se purificó secuencialmente en resinas de níquel y luego de glutatión. Los tampones fueron los siguientes: el primer tampón de lavado: imidazol 25 mM. Tampón de elución SBK1 para etiqueta de polihistidina: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, imidazol 250 mM. Tampón de elución SBK1 para etiqueta GST: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, glutatión 10 mM. Tampón de elución Flag-TAK1-TAB1: Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, glicerol al 2 %, 0,15 μg ml-1 3 × péptido Flag.

Flag – His6 – WNK3 se purificó secuencialmente en níquel y luego en resinas anti-Flag. Los tampones fueron los siguientes: el primer tampón de lavado: imidazol 25 mM. Tampón de elución de etiqueta de bandera (sin cloruro): Tris 50 mM, pH 7,5, acetato de magnesio 2 mM, glicerol al 2 %, 0,15 μg ml-1 3 × péptido Flag.

Flag-ATR (S1333A) (350 μl) y HA-ATRIP (150 μg) se cotransfectaron en células Expi293 y se incubaron durante un día adicional después de la adición de potenciadores (4 días después de la transfección). Los buffers fueron los siguientes. Tampón de lisis ATR: HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, Tween-20 al 0,25 %, MgCl2 2 mM, DTT. Tampón de lavado ATR: HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Brij-35 al 0,01%, MgCl2 2 mM, ATP 5 mM, DTT. Tampón de elución ATR: HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Brij-35 al 0,01 %, DTT, 0,15 μg ml-1 3 × péptido Flag.

Los eluatos se concentraron a 1 ml en tubos Amicon MWCO de 100 kDa y se resolvieron utilizando la columna MonoS en un gradiente de NaCl de 0 a 1 M (tampón: Bis-Tris 25 mM, pH 6,9, Brij-35 al 0,01% y TCEP 5 mM). Se recogió un total de 1 ml de cada fracción. Las fracciones 1 a 4 se combinaron y concentraron a 1 ml usando un filtro MWCO de 100 kDa y se resolvieron usando exclusión por tamaño (Superose 6) en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 200 mM, Brij-35 al 0,01% y TCEP 5 mM. Se recogió un total de 1 ml de cada fracción. Se verificó que las fracciones 11 a 14 eran un complejo ATR-ATRIP puro en SDS-PAGE.

Los complejos SMG1-SMG9 se purificaron a partir de células HEK293T como se describió anteriormente70. RIPK1, RIPK2 y RIPK3 se purificaron a partir de células de insecto (Sf9) como se describió anteriormente71. Las siguientes quinasas activas recombinantes se obtienen de otros laboratorios. Los complejos CDK12-CycK, CDK13-CycK y CDK9-CycT activos recombinantes fueron obsequios de M. Geyer72,73. DCAMKL1/DCLK1 y MELK activos recombinantes fueron proporcionados como obsequio por N. Gray, H.-T. Huang y K. Westover, Y. Liu y W. Harshburger74,75,76. El complejo PRPK activo recombinante (longitud completa) –CGI121/TPRKB (longitud completa) fue proporcionado como regalo por L. Wan y F. Sicheri77. El HASPIN activo recombinante (452–798) fue un regalo de A. Musacchio78. El YSK1 activo recombinante fue proporcionado como regalo por X. Luo79. La CK1G2 recombinante fue proporcionada como regalo por S. Knapp. En la Tabla complementaria 1 se proporciona una lista de catálogos y números de lote de quinasas recombinantes compradas.

Se añadió quinasa recombinante a una placa de 384 pocillos que contenía mezclas de bibliotecas de sustratos peptídicos en fase de solución a 50 µM (Anaspec, AS-62017-1 y AS-62335). La reacción se inició con la adición de ATP 50 μM (50 μCi ml-1 γ-32P-ATP, Perkin-Elmer) y se incubó durante 90 min. Las condiciones del ensayo para cada quinasa se describen en la Tabla complementaria 1 (refs. 80,81,82,83,84). Una vez completada la reacción, las soluciones se colocaron en membranas conjugadas con estreptavidina (Promega, V2861), donde los péptidos se asociaron estrechamente a través de su biotinilación C-terminal. Las membranas se enjuagaron y luego se tomaron imágenes usando el fosforimager (GE) Typhoon FLA 7000 para medir el grado de fosforilación de péptidos. Los datos sin procesar (archivo GEL) se cuantificaron utilizando ImageQuant (GE) para generar matrices de densitometría (Tabla complementaria 2). Para la quinasa ALPHAK3, las manchas se normalizaron con respecto al fondo circundante, debido a la variación espacial en la señal de fondo. PDHK1 y PDHK4 mostraron especificidad dual por serina y tirosina. Para estas quinasas, utilizamos una biblioteca de sustratos peptídicos personalizada sin residuos de tirosina en posiciones aleatorias.

En total, se combinaron 283 motivos de quinasa humana, un motivo de un ortólogo de quinasa de ratón (CDKL5), un motivo de un ortólogo de quinasa de rata (KIS) y un motivo de un ortólogo de quinasa de artrópodo Pediculus humanus corporis (PINK1), con 17 quinasas humanas. motivos que publicamos anteriormente, incluidos AKT185, SRPK135, SRPK235, SRPK335, CK1D35, DYRK1A86, DYRK286, GSK3A86, GSK3B86, CK1A86, CK1E86, CK1G186, CDK1087, CDK288, CDK388, CDK1888 y CDK7 89.

Para los experimentos de control cero en la Fig. 6 de datos ampliados, se sintetizaron péptidos biotinilados que contenían solo serina o treonina como fosfoaceptor, donde las nueve posiciones circundantes contenían mezclas degeneradas de los 20 aminoácidos naturales, excluyendo serina, treonina, tirosina y cisteína. .

Las matrices de densitometría se normalizaron en columnas en todas las posiciones mediante la suma de los 17 aminoácidos aleatorizados (excluyendo serina, treonina y cisteína), para producir PSSM (Tabla complementaria 2). PDHK1 y PDHK4 se normalizaron a los 16 aminoácidos aleatorizados (excluyendo serina, treonina, cisteína y, además, tirosina), correspondientes a la biblioteca de péptidos personalizada de forma única que perfilaba estas quinasas. La fila de cisteína se amplió según su mediana para que fuera 1/17 (1/16 para PDHK1 y PDHK4). Los valores de serina y treonina en cada posición se establecieron como la mediana de esa posición. La proporción de favorabilidad de los fosfoaceptores de serina versus treonina (S0 y T0, respectivamente) se determinó sumando los valores de las filas de serina y treonina en la matriz de densitometría (SS y ST, respectivamente), teniendo en cuenta la diferente composición de serina versus treonina de las posiciones central (1:1) y periférica (solo serina o solo treonina) (Sctrl y Tctrl, respectivamente), y luego normalizando al valor más alto entre los dos (S0 y T0, respectivamente, Nota complementaria 1).

El dendrograma de la Fig. 2 se generó utilizando las matrices normalizadas con los 20 aminoácidos no modificados, así como con fosfotreonina y fosfotirosina. La matriz de vinculación se calculó utilizando el paquete SciPy en Python (v.3.7.6), utilizando el método Ward. Los resultados se convirtieron al formato de árbol de Newick y se representaron utilizando FigTree (v.1.4.4).

Para calificar los sustratos, los valores de los aminoácidos correspondientes en las posiciones correspondientes se multiplicaron y ampliaron por la probabilidad de un péptido aleatorio (Nota complementaria 2).

Para la puntuación percentil de un sustrato por una quinasa determinada, primero calculamos la distribución de puntuación a priori de esa quinasa PSSM puntuando un fosfoproteoma Ser/Thr de referencia que comprende 82,735 sitios identificados usando el método discutido anteriormente (Fig. 3a). La puntuación percentil de un par quinasa-sustrato se define como la clasificación percentil del sustrato dentro de la distribución de puntuación de cada quinasa34. Este valor se utilizó al analizar todos los sitios de fosforilación detectados para el enriquecimiento de quinasa.

Los sitios de fosforilación únicos (sin incluir péptidos multifosforilados) en los estudios de fosfoproteómica analizados fueron puntuados por todas las quinasas caracterizadas (303 Ser/Thr quinasas), y sus rangos en la distribución de puntuación de fosfoproteoma conocida se determinaron como se describió anteriormente. Para cada sitio fosforilado individualmente y no duplicado, las quinasas que se ubicaron entre las 15 quinasas principales para las quinasas Ser/Thr se consideraron quinasas bioquímicamente favorecidas para ese sitio de fosforilación. Para evaluar el enriquecimiento del motivo quinasa en conjuntos de datos de fosfoproteómica, comparamos el porcentaje de sitios de fosforilación para los cuales se predijo cada quinasa entre los sitios de fosforilación regulados hacia arriba/abajo (aumentados/disminuidos, respectivamente) (sitios con |log2[cambio de veces]| igual o mayor que el umbral log[fold change]), versus el porcentaje de sitios de fosforilación bioquímicamente favorecidos para esa quinasa dentro del conjunto de sitios no regulados (sin cambios) en este estudio (sitios con |log2[fold change]| menos que el log[fold change] límite). Se determinó que el umbral de cambio de pliegue transformado logarítmicamente era 1,5 para todos los paneles en la Fig. 4, excepto para la Fig. 4e, en la que el umbral se estableció en 0,5 debido al rango bajo del log[cambio de pliegue] en los datos. Las tablas de contingencia se corrigieron mediante la corrección de Haldane (sumando 0,5 a los casos con cero en uno de los conteos). La significación estadística se determinó mediante las pruebas exactas de Fisher unilaterales y los valores de P correspondientes se ajustaron mediante el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Las quinasas que se enriquecieron significativamente (P ajustada ≤ 0,1) o se agotaron (log2 [factor de frecuencia] <0) para el análisis tanto regulado hacia arriba como hacia abajo se excluyeron del análisis posterior. Luego, para cada quinasa, se seleccionó el lado de enriquecimiento más significativo (regulado hacia arriba o hacia abajo) sobre la base del valor de P ajustado y se presentó en los gráficos del volcán.

Los logotipos de secuencia se crearon utilizando el paquete logomaker en Python90. Para las quinasas individuales, se utilizó la matriz normalizada, donde la altura de cada letra es la relación entre su valor y el valor mediano de esa posición. Las alturas de serina y treonina en la posición central (posición cero) se establecieron en la relación entre su favorabilidad. Para grupos agrupados de quinasas, la matriz promedio se calculó y se presentó como logotipo de secuencia como se describió anteriormente.

Para los datos ampliados de la figura 7, las quinasas se ordenaron según sus valores log2[S0/T0]. Para el logotipo de secuencia, se obtuvieron dominios de quinasa de 290 quinasas disponibles a partir de secuencias de quinasa previamente alineadas91. Las alineaciones con los residuos Met1-Leu296 en CDK2 (Protein Data Bank (PDB): 1QMZ) se obtuvieron para cada quinasa, y las frecuencias de aminoácidos en incrementos de 15 quinasas se calcularon y representaron como un logotipo de secuencia.

Las relaciones quinasa-sustrato validadas experimentalmente se obtuvieron de PhosphoSitePlus (julio de 2021). El número de informes para cada par se determinó mediante la suma de los informes in vivo e in vitro.

El esquema experimental y los modelos ilustrativos se generaron utilizando BioRender (https://biorender.com/). Las imágenes del árbol Kinome se generaron y modificaron utilizando Coral (//phanstiel-lab.med.unc.edu/CORAL/). Las ilustraciones estructurales se generaron usando PyMOL. Los dominios de quinasa genérica en las Figs. 1 y 3 fueron los siguientes: PKAα (PDB: 1ATP). Las estructuras de quinasa y sustrato en la Fig. 3 fueron las siguientes: ATM (PDB: 7SIC) 92 y p53 (quimera de AlphaFold AF-P04637-F1-model_v2_1 (1–95) 61 y 2ATA (96–292) 92) (Fig. . 3c), y PHKG2 (PDB: 2Y7J)92 y PYGM (PDB: 1ABB)92 (Fig. 3b).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados (archivos RAW) y analizados en este estudio se proporcionan en este documento. Todos los plásmidos generados en este estudio se depositaron en Addgene o estuvieron disponibles previa solicitud.

Las herramientas analíticas utilizadas en este estudio y el código subyacente están disponibles para el público en línea (https://kinase-library.phosphosite.org).

En la versión de la Tabla complementaria 2 publicada originalmente con este artículo, los datos de la hoja “ser_thr_all_raw_matrices” se organizaron por error en columnas en lugar de filas, y ahora se transponen correctamente en la Tabla complementaria 2 revisada que acompaña a este artículo.

Cohen, P. Los orígenes de la fosforilación de proteínas. Nat. Biol celular. 4, E127-E130 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Manning, G., Whyte, DB, Martinez, R., Hunter, T. y Sudarsanam, S. El complemento de proteína quinasa del genoma humano. Ciencia 298, 1912-1934 (2002).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hornbeck, PV y cols. 15 años de PhosphoSitePlus®: integrando sitios modificados postraduccionalmente, variantes de enfermedades e isoformas. Ácidos nucleicos res. 47, D433–D441 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Ochoa, D. et al. El panorama funcional del fosfoproteoma humano. Nat. Biotecnología. 38, 365–373 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Fuhs, SR y Hunter, T. pHisforilación: el surgimiento de la fosforilación de histidina como una modificación reguladora reversible. actual. Opinión. Biol celular. 45, 8-16 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Hunter, T. Por qué la naturaleza eligió el fosfato para modificar las proteínas. Filos. Trans. R. Soc. B 367, 2513–2516 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Lahiry, P., Torkamani, A., Schork, NJ y Hegele, RA Mutaciones de quinasa en enfermedades humanas: interpretación de las relaciones genotipo-fenotipo. Nat. Rev. Genet. 11, 60–74 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Berginski, ME y cols. The Dark Kinase Knowledgebase: un compendio en línea de conocimientos y resultados experimentales de quinasas poco estudiadas. Ácidos nucleicos res. 49, D529–D535 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Edwards, AM y cols. Demasiados caminos no transitados. Naturaleza 470, 163-165 (2011).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Needham, EJ, Parker, BL, Burykin, T., James, DE y Humphrey, SJ Iluminando el fosfoproteoma oscuro. Ciencia. Señal. 12, eau8645 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Lemeer, S. & Heck, AJ La explosión de datos fosfoproteómicos. actual. Opinión. Química. Biol. 13, 414–420 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Aebersold, R. & Mann, M. Exploración espectrométrica de masas de la estructura y función del proteoma. Naturaleza 537, 347–355 (2016).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Riley, NM & Coon, JJ Fosfoproteómica en la era de la elaboración de perfiles proteomas rápidos y profundos. Anal. Química. 88, 74–94 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Kemp, BE, Graves, DJ, Benjamini, E. & Krebs, EG Papel de múltiples residuos básicos en la determinación de la especificidad del sustrato de la proteína quinasa dependiente de AMP cíclico. J. Biol. Química. 252, 4888–4894 (1977).

Artículo CAS Google Scholar

Kemp, BE y Pearson, RB Motivos de secuencia de reconocimiento de proteína quinasa. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 15, 342–346 (1990).

Artículo CAS Google Scholar

Marin, O., Meggio, F., Marchiori, F., Borin, G. y Pinna, LA Especificidad de sitio de la caseína quinasa-2 (TS) del citosol de hígado de rata: un estudio con sustratos peptídicos modelo. EUR. J. Bioquímica. 160, 239–244 (1986).

Artículo CAS Google Scholar

Clark-Lewis, I., Sanghera, JS y Pelech, S. Definición de una secuencia consenso para el reconocimiento de sustrato peptídico por p44mpk, la proteína quinasa básica de mielina activada por meiosis. J. Biol. Química. 266, 15180–15184 (1991).

Artículo CAS Google Scholar

Songyang, Z. y col. Uso de una biblioteca de péptidos orientados para determinar los sustratos óptimos de proteínas quinasas. actual. Biol. 4, 973–982 (1994).

Artículo CAS Google Scholar

Hutti, JE et al. Un método rápido para determinar la especificidad de fosforilación de la proteína quinasa. Nat. Métodos 1, 27–29 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Mok, J. y col. Descifrando la especificidad de la proteína quinasa mediante análisis a gran escala de motivos del sitio de fosforilación de levadura. Ciencia. Señal. 3, ra12 (2010).

Artículo de Google Scholar

Pearce, LR, Komander, D. y Alessi, DR Los aspectos prácticos de las proteínas quinasas AGC. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 11, 9-22 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Kim, S.-T., Lim, D.-S., Canman, CE y Kastan, MB Especificidades del sustrato e identificación de supuestos sustratos de miembros de la familia de quinasas ATM. J. Biol. Química. 274, 37538–37543 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

O'Neill, T. y col. Utilización de bibliotecas de péptidos orientados para identificar motivos de sustrato seleccionados por ATM. J. Biol. Química. 275, 22719–22727 (2000).

Artículo de Google Scholar

Shah, NH y cols. Un mecanismo de selección electrostática controla la señalización secuencial de quinasas aguas abajo del receptor de células T. eLife 5, e20105 (2016).

ADS del artículo Google Scholar

Zhu, G. y col. La desaprobación excepcional por la prolina en la posición P + 1 entre las quinasas AGC y CAMK establece una especificidad recíproca entre ellas y las quinasas dirigidas por prolina. J. Biol. Química. 280, 10743–10748 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Alejandro, J. et al. La exclusividad espacial combinada con la selección positiva y negativa de motivos de fosforilación es la base de la señalización mitótica dependiente del contexto. Ciencia. Señal. 4, ra42 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Reiter, E. y Lefkowitz, RJ GRK y β-arrestinas: funciones en el silenciamiento, el tráfico y la señalización de receptores. Tendencias Endocrinol. Metab. 17, 159-165 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Moore, CA, Milano, SK y Benovic, JL Regulación del tráfico de receptores por GRK y arrestinas. Año. Rev. Physiol. 69, 451–482 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Bradley, D. y col. Análisis basado en secuencia y estructura de determinantes de especificidad en proteínas quinasas eucariotas. Rep. Celular 34, 108602 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Taylor, SS y Kornev, AP Proteínas quinasas: evolución de proteínas reguladoras dinámicas. Tendencias Bioquímica. Ciencia. 36, 65–77 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Creixell, P. et al. Desenmascarar los determinantes de la especificidad en el cinema humano. Celda 163, 187–201.

Artículo CAS Google Scholar

Miller, ML y cols. Atlas de motivos lineales para la señalización dependiente de la fosforilación. Ciencia. Señal. 1, ra2 (2008).

Artículo de Google Scholar

Chen, C. y col. Identificación de un determinante importante de la especificidad del fosfoaceptor de serina-treonina quinasa. Mol. Celda 53, 140-147 (2014).

Artículo de Google Scholar

Yaffe, MB, Leparc, GG, Lai, J., Obata, T., Volinia, S. y Cantley, LC Un enfoque de escaneo de perfiles basado en motivos para la predicción de vías de señalización en todo el genoma. Nat. Biotecnología. 19, 348–353 (2001).

Yaron, TM et al. Proteínas quinasas del huésped necesarias para la fosforilación de la nucleocápside del SARS-CoV-2 y la replicación viral. Ciencia. Señal. 15, eabm0808 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Fischer, EH, Graves, DJ, Crittenden, ERS & Krebs, EG Estructura del sitio fosforilado en la fosforilasa b para una reacción. J. Biol. Química. 234, 1698-1704 (1959).

Artículo CAS Google Scholar

Xu, B.-e, Wilsbacher, JL, Collisson, T. y Cobb, MH El sitio de unión a ERK N-terminal de MEK1 es necesario para la fosforilación por retroalimentación eficiente mediante ERK2 in vitro y la activación de ERK in vivo. J. Biol. Química. 274, 34029–34035 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Malumbres, M. et al. Quinasas dependientes de ciclina: un retrato de familia. Nat. Biol celular. 11, 1275-1276 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Eick, D. y Geyer, M. El código del dominio carboxi-terminal (CTD) de la ARN polimerasa II. Química. Rev. 113, 8456–8490 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Cohen, P. & Frame, S. El renacimiento de GSK3. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 2, 769–776 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Meng, Z. y col. Las quinasas de la familia MAP4K actúan en paralelo a MST1/2 para activar LATS1/2 en la vía del hipopótamo. Nat. Comunitario. 6, 8357 (2015).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Shaywitz, AJ & Greenberg, ME CREB: un factor de transcripción inducido por estímulos activado por una amplia gama de señales extracelulares. Año. Rev. Bioquímica. 68, 821–861 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Rigbolt, KT y Blagoev, B. Fosfoproteómica cuantitativa para caracterizar redes de señalización. Semín. Desarrollo celular. Biol. 23, 863–871 (2012).

Tagliabracci, VS et al. Una sola quinasa genera la mayor parte del fosfoproteoma secretado. Celda 161, 1619-1632 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Needham, EJ y cols. La fosfoproteómica de los factores estresantes celulares agudos que se dirigen a las redes de señalización del ejercicio revela interacciones farmacológicas que regulan la secreción de proteínas. Representante de celda 29, 1524-1538 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Kettenbach, AN et al. La fosfoproteómica cuantitativa identifica sustratos y módulos funcionales de las actividades de las quinasas tipo Aurora y Polo en células mitóticas. Ciencia. Señal. 4, rs5 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

van Vugt, MA et al. Una red de retroalimentación de fosforilación mitótica conecta Cdk1, Plk1, 53BP1 y Chk2 para inactivar el punto de control de daño del ADN G2/M. PLoS Biol. 8, e1000287 (2010).

Artículo de Google Scholar

Macůrek, L. et al. La aurora A activa la quinasa-1 tipo polo para promover la recuperación del punto de control. Naturaleza 455, 119-123 (2008).

ADS del artículo Google Scholar

Invierno, M. et al. Descifrando la respuesta aguda del fosfoproteoma celular a la irradiación con rayos X, protones e iones de carbono. Mol. Celúla. Proteoma. 16, 855–872 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Reinhardt, HC, Aslanian, AS, Lees, JA y Yaffe, MB Las células con deficiencia de p53 dependen de la señalización de puntos de control mediada por ATM y ATR a través de la vía p38MAPK/MK2 para sobrevivir después de un daño en el ADN. Célula cancerosa 11, 175–189 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Reinhardt, HC & Yaffe, MB Quinasas que controlan el ciclo celular en respuesta al daño del ADN: Chk1, Chk2 y MK2. actual. Opinión. Biol celular. 21, 245–255 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Xie, S. y col. Plk3 vincula funcionalmente el daño del ADN con la detención del ciclo celular y la apoptosis, al menos en parte, a través de la vía p53. J. Biol. Química. 276, 43305–43312 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

González-Hunt, C. et al. Daño del ADN mitocondrial como biomarcador potencial de la actividad de la quinasa LRRK2 en la enfermedad de Parkinson LRRK2. Ciencia. Rep. 10, 17293 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Humphrey, SJ y cols. El fosfoproteoma dinámico de adipocitos revela que Akt regula directamente mTORC2. Metabolismo celular. 17, 1009-1020 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Mertins, P. y col. Un marco integrador revela eventos de señalización a transcripción en la señalización del receptor tipo peaje. Representante celular 19, 2853–2866 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Johnson, GL y Lapadat, R. Vías de proteína quinasa activadas por mitógenos mediadas por proteínas quinasas ERK, JNK y p38. Ciencia 298, 1911-1912 (2002).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Miller, CJ y Turk, BE Homing in: mecanismos de direccionamiento de sustrato por parte de proteínas quinasas. Tendencias Bioquímica. Ciencia 43, 380–394 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Linding, R. y col. Descubrimiento sistemático de redes de fosforilación in vivo. Celda 129, 1415-1426 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Joughin, BA, Liu, C., Lauffenburger, DA, Hogue, CW y Yaffe, MB Las proteínas quinasas muestran una dependencia interposicional mínima de la secuencia del sustrato: posibles implicaciones para la evolución de las redes de señalización. Filos. Trans. R. Soc. B 367, 2574–2583 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Baek, M. y col. Predicción precisa de estructuras e interacciones de proteínas utilizando una red neuronal de tres vías. Ciencia 373, 871–876 (2021).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Saltador, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Sanz-García, M. et al. El perfil de sustrato de las quinasas humanas relacionadas con la vaccinia identifica a la coilina, una proteína nuclear del cuerpo de Cajal, como un objetivo de fosforilación con implicaciones neurológicas. J. Proteoma. 75, 548–560 (2011).

Artículo de Google Scholar

Sekiguchi, M. y col. Identificación de anfifisina 1 como sustrato endógeno para CDKL5, una proteína quinasa asociada con el trastorno del desarrollo neurológico ligado al cromosoma X. Arco. Bioquímica. Biofísica. 535, 257–267 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Wynn, RM, Davie, JR, Cox, RP y Chuang, DT Las chaperonas GroEL y GroES promueven el ensamblaje de heterotetrámeros (α2β2) de la alfa-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada mitocondrial de mamíferos en Escherichia coli. J. Biol. Química. 267, 12400–12403 (1992).

Artículo CAS Google Scholar

Song, J.-L., Li, J., Huang, Y.-S. & Chuang, DT Encapsulación de un conjunto intermedio de 86 kDa dentro de las cavidades de GroEL y su variante de anillo único SR1 por GroES. J. Biol. Química. 278, 2515–2521 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Thevakumaran, N. y col. La estructura cristalina de un monómero del dominio quinasa BRAF explica la base de la regulación alostérica. Nat. Estructura. Mol. Biol. 22, 37–43 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Luzwick, JW, Nam, EA, Zhao, R. & Cortez, D. La mutación de la serina 1333 en las repeticiones ATR HEAT crea una quinasa hiperactiva. MÁS UNO 9, e99397 (2014).

ADS del artículo Google Scholar

Albanese, SK y cols. Una biblioteca abierta de construcciones de dominio de quinasa humana para la expresión bacteriana automatizada. Bioquímica 57, 4675–4689 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Manceau, V. y col. La fosforilación importante de SF1 en motivos Ser-Pro adyacentes mejora la interacción con U2AF65. FEBS J. 273, 577–587 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Melero, R. et al. Estructuras de los complejos SMG1-UPF: SMG1 contribuye a regular la activación de UPF1 dependiente de UPF2 en NMD. Estructura 22, 1105-1119 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Najjar, M. et al. Diseño guiado por estructura de inhibidores híbridos potentes y selectivos basados ​​en ponatinib para RIPK1. Representante celular 10, 1850–1860 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Czudnochowski, N., Bösken, CA y Geyer, M. La fosforilación de serina-7, pero no de serina-5, prepara la ARN polimerasa II CTD para el reconocimiento de P-TEFb. Nat. Comunitario. 3, 842 (2012).

ADS del artículo Google Scholar

Greifenberg, AK y cols. Análisis estructural y funcional del complejo Cdk13/Ciclina K. Representante celular 14, 320–331 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Liu, Y. et al. El conjunto de herramientas de biología química para DCLK1 revela su conexión con el procesamiento de ARN. Química celular. Biol. 27, 1229-1240 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Ferguson, FM y cols. Descubrimiento de un inhibidor selectivo de la doblecortina como la quinasa 1. Nat. Química. Biol. 16, 635–643 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Huang, H.-T. et al. MELK no es necesario para la proliferación de células de cáncer de mama de tipo basal. eLife 6, e26693 (2017).

Artículo de Google Scholar

Wan, LC y col. El análisis proteómico del complejo KEOPS humano identifica C14ORF142 como una subunidad central homóloga a la levadura Gon7. Ácidos nucleicos res. 45, 805–817 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Villa, F. y col. Estructura cristalina del dominio catalítico de Haspin, una quinasa atípica implicada en la organización de la cromatina. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 106, 20204–20209 (2009).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Bae, SJ, Ni, L. & Luo, X. STK25 suprime la señalización del hipopótamo regulando el antagonismo SAV1-STRIPAK. eLife 9, e54863 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Murillo-de-Ozores, AR, Chávez-Canales, M., de Los Heros, P., Gamba, G. & Castañeda-Bueno, M. Procesos fisiológicos modulados por la vía de señalización de la quinasa WNK-SPAK/OSR1 sensible al cloruro y los cotransportadores de cloruro acoplados a cationes. Frente. Fisiol. 11, 585907 (2020).

Filippi, BM y cols. MO25 es un regulador maestro de las proteínas quinasas SPAK/OSR1 y MST3/MST4/YSK1. EMBO J. 30, 1730-1741 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

Zhou, P. y col. La alfa-quinasa 1 es un receptor inmune innato citosólico para la ADP-heptosa bacteriana. Naturaleza 561, 122-126 (2018).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Taipale, M. et al. El análisis cuantitativo de las interacciones HSP90-cliente revela principios de reconocimiento de sustratos. Celda 150, 987–1001 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Klatt, F. y col. Una hélice de activación de MED12 colocada con precisión estimula la actividad de la quinasa CDK8. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 117, 2894–2905 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Balasuriya, N. et al. Selectividad de sustrato dependiente de fosforilación de la proteína quinasa B (AKT1). J. Biol. Química. 295, 8120–8134 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Zheng, Y. et al. Regulación del metabolismo del folato y la metionina mediante la fosforilación multisitio de la metilenetetrahidrofolato reductasa humana. Ciencia. Rep. 9, 4190 (2019).

ADS del artículo Google Scholar

Robert, T. y otros. Desarrollo de un ensayo de detección de quinasa in vitro CDK10/CycM e identificación de los primeros inhibidores de molécula pequeña. Frente. Química. 8, 147 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Ferguson, FM y cols. Descubrimiento de inhibidores covalentes de CDK14 con especificidad pan-familia TAIRE. Química celular. Biol. 26, 804–817 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Rimel, JK y cols. La inhibición selectiva de CDK7 revela objetivos de alta confianza y nuevos modelos para la función TFIIH en la transcripción. Desarrollo de genes. 34, 1452-1473 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Wagih, O. ggseqlogo: un paquete R versátil para dibujar logotipos de secuencias. Bioinformática 33, 3645–3647 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Modi, V. & Dunbrack Jr, RL Un alineamiento de secuencias múltiples estructuralmente validado de 497 dominios de proteína quinasa humana. Ciencia. República 9, 19790 (2019).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Berman, HM El banco de datos de proteínas. Ácidos nucleicos res. 28, 235–242 (2000).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a M. Begley y T. DeFalco por sus útiles debates y asistencia técnica; y T. Levy, S. Beausoleil, L. D'Amato, P. Lobo, M. Tran y C. Valencia por su apoyo técnico. TMY agradece a S. Yaron, N. Yaron, JR Haddad y S. Haddad por su apoyo; y JLJ agradece a M. Bak-Johnson por su apoyo. Esta investigación fue apoyada por el premio FELLOW de la Leukemia & Lymphoma Society (para JLJ y LCC); El Instituto Nacional de Salud concede P01 CA120964 (a LCC), R35-CA197588 (a LCC), P01-CA117969 (a LCC), R35-ES028374 (a MBY), R01-CA226898 (a MBY), R01-GM104047 (a BET y MBY), U24 DK116204 (a BET y LCC) y R35-GM139550 (a DJT); el Brain Tumor Award C42454/A28596, financiado conjuntamente por Cancer Research UK y Brain Tumor Charity (a MBY); la Fundación Charles y Marjorie Holloway (a MBY); y el Centro de Medicina Oncológica de Precisión del MIT. También brindó apoyo la Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer P30-CA14051 y T32CA203702 (a ERK) del Instituto Nacional del Cáncer.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jared L. Johnson, Tomer M. Yaron

Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Jared L. Johnson, Tomer M. Yaron, Emily M. Huntsman, Alexander Kerelsky, Junho Song, Amit Regev, Ting-Yu Lin, Katarina Liberatore, Daniel M. Cizin, Benjamin M. Cohen, Yilun Ma, Edward R. Kastenhuber, Marcus D. Gonçalves, John Blenis y Lewis C. Cantley

Departamento de Medicina, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Jared L. Johnson, Tomer M. Yaron, Emily M. Huntsman, Alexander Kerelsky, Junho Song, Amit Regev, Ting-Yu Lin, Katarina Liberatore, Daniel M. Cizin, Benjamin M. Cohen, Yilun Ma, Edward R. Kastenhuber y Lewis C. Cantley

Instituto Englander de Medicina de Precisión, Instituto de Biomedicina Computacional, Medicina Weill Cornell, Nueva York, NY, EE. UU.

Tomer M. Yaron, Alexander Kerelsky y Olivier Elemento

Departamento de Fisiología y Biofísica, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Tomer M. Yaron & Olivier Elemento

Programa Tri-Institucional de Doctorado en Biología y Medicina Computacional, Weill Cornell Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center y The Rockefeller University, Nueva York, NY, EE. UU.

Tomer Yaron

Escuela de Graduados en Ciencias Médicas Weill Cornell, Programa de Biología Celular y del Desarrollo, Nueva York, NY, EE. UU.

Ting-Yu Lin

Departamento de Medicina, División de Hematología/Oncología, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Neil Vasan

Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center, Nueva York, NY, EE. UU.

Neil Vasan

Laboratorio de Ciencias de la Computación e Inteligencia Artificial, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Konstantin Krismer

Centro de Medicina Oncológica de Precisión, Instituto Koch de Biología Integrativa del Cáncer, Departamentos de Biología e Ingeniería Biológica, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.

Konstantin Krismer, Bert van de Kooij, Anne E. van Vlimmeren y Michael B. Yaffe

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Jaylissa Torres Robles & Benjamín E. Turk

Departamento de Química, Universidad de Yale, New Haven, CT, EE. UU.

Jaylissa Torres Robles

Instituto de Genética, Universidad Técnica de Braunschweig, Braunschweig, Alemania

Nicole Andrée-Busch y Norbert F. Käufer

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina Rutgers Robert Wood Johnson, Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.

Maxim V. Dorovkov y Alexey G. Riazanov

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana, Indianápolis, IN, EE. UU.

Yuichiro Takagi

División de Endocrinología, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Marcus D. Gonçalves

Departamento de Genética y Ciencias Genómicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Benjamín D. Hopkins

Departamento de Bioquímica, Universidad de Colorado, Boulder, CO, EE. UU.

Dylan J. Taatjes

SABNP, Univ Evry, INSERM U1204, Universidad Paris-Saclay, Evry, Francia

Alejandro Maucuer

Departamento de Medicina de Investigación, Facultad de Medicina, Universidad de Ryukyus, Nishihara-cho, Japón

Akio Yamashita

Departamento de Biología Química, Molecular y del Desarrollo, Facultad de Medicina de la Universidad de Tufts, Boston, MA, EE. UU.

Alexéi Degterev

Departamento de Bioinformática, Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, EE. UU.

http://dx.doi.org/10.1037/0021-843X.112.2.202 Sean D. Landry, Bin Zhang, Ian Cossentino y Peter V. Hornbeck

Rewire Tx, Universidad Humboldt de Berlín, Berlín, Alemania

Revestimiento de runas

Departamento de Farmacología, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

John Blenis

Departamento de Bioquímica, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

John Blenis

Divisiones de Cirugía de Cuidados Intensivos, Traumatología y Cuidados Críticos Quirúrgicos, y Oncología Quirúrgica, Departamento de Cirugía, Centro Médico Beth Israel Deaconess, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Michael B.Yaffe

Programa de Oncología Quirúrgica, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.

Michael B.Yaffe

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JLJ, TMY, LCC, MBY y BET concibieron el proyecto, diseñaron experimentos y analizaron los datos. JLJ y TMY generaron cifras. JLJ realizó los experimentos de PSPA. TMY dirigió los análisis computacionales. TMY, EMH, AK, DMC, BMC, KK, MU, JL, SDL, BZ e IC realizaron análisis computacionales. JLJ, JS, AR, T.-YL, NV, KL, YM, AD, AY y AM generaron proteínas recombinantes. JLJ, TMY, BET, JTR, MBY y LCC realizaron modelos estructurales. PVH, DJT, YT, NA-B., NFK, BvdK, AEvV, MVD, AGR, ERK, MDG, BDH, OE, RL y JB aportaron datos y participaron en debates. JLJ, TMY, MBY, BET y LCC escribieron y editaron el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Benjamin E. Turk, Michael B. Yaffe o Lewis C. Cantley.

LCC es fundador y miembro de la junta directiva de Agios Pharmaceuticals y es fundador y recibe apoyo de investigación de Petra Pharmaceuticals; figura como inventor en una patente (WO2019232403A1, Weill Cornell Medicine) para la terapia combinada para enfermedades o trastornos asociados a PI3K y la identificación de intervenciones terapéuticas para mejorar la respuesta a los inhibidores de PI3K para el tratamiento del cáncer; es cofundador y accionista de Faeth Therapeutics; tiene participación accionaria y consultoría para Cell Signaling Technologies, Volastra, Larkspur y 1 Base Pharmaceuticals; y consultas para Loxo-Lilly. MBY recibe apoyo para la investigación de Cardiff Oncology. TMY es cofundador y accionista y forma parte de la junta directiva de DESTROKE, una nueva empresa que desarrolla tecnología móvil para la detección clínica automatizada de accidentes cerebrovasculares. JLJ ha recibido honorarios de consultoría de Scorpion Therapeutics y Volastra Therapeutics. OE es fundador y accionista de Volastra Therapeutics y OneThree Biotech; es miembro del consejo asesor científico de Owkin, Freenome, Genetic Intelligence, Acuamark y Champions Oncology; y recibe apoyo para la investigación de Eli Lilly, Janssen y Sanofi. DJT es miembro del consejo asesor científico de Dewpoint Therapeutics. AD es accionista de Denali Therapeutics; y recibe apoyo de investigación de Interline Therapeutics. NV informa actividades de consultoría para Novartis y forma parte del consejo asesor científico de Heligenics. MDG es cofundador y accionista de Faeth Therapeutics, que desarrolla terapias dietéticas y farmacológicas para el cáncer; y ha recibido honorarios por conferencias y/o consultoría de Pfizer, Novartis, Scorpion Therapeutics y Faeth Therapeutics.

Nature agradece a Tony Hunter y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Representación en diagrama de Venn de los porcentajes de tres características prominentes del motivo quinasa Ser/Thr, pertenecientes a los Grupos 1, 2 y 3 en la Fig. 2, en 82,735 sitios de fosforilación de serina y treonina humana identificados con seguridad en experimentos de espectrometría de masas4. Los residuos fosforilados en los logotipos se representan como S/T.

Subcategorización del Grupo 1 de la Fig. 2 en 11 clases de motivos.

Subcategorización del Grupo 2 de la Fig. 2 en 5 clases de motivos.

Subcategorización del Grupo 3 de la Fig. 2 en 8 clases de motivos.

a, Péptido sintético de su complejo con PAK4 (PDB: 2Q0N) modelado sobre WNK3 (PDB: 5O26). El círculo punteado resalta una bolsa hidrofóbica poco profunda que contiene un residuo de Phe +3. b, péptido GSK3 de su complejo con AKT2 (PDB: 1O6L) modelado sobre CAMKK2 (PDB: 2ZV2). El círculo indica una bolsa hidrofóbica que podría acomodar un residuo alifático −2. c, Péptido monofosforilado de p63 unido a CK1δ (PDB: 6RU6) modelado en GRK2 (PDB: 1YM7). El círculo muestra un potencial superficial positivo en las proximidades de los residuos pSer −2 y −3. d, el péptido p63 unido a CK1δ (PDB: 6RU8) se modeló en YANK1 (PDB: 4FR4) mostrando sitios de unión potenciales para residuos fosforilados −3 y +2. La electrostática de superficie se representa con valores de potencial de Coulombic que se calcularon en ChimeraX y se representaron mediante barras de escala (kcal/mol·e).

a, ensayos de fosforilación in vitro con quinasas recombinantes y péptidos sustrato que contienen fosfoaceptores de serina o treonina. Se muestran los resultados de 208 quinasas Ser/Thr recombinantes. b, Gráfico de correlación de los resultados experimentales en (a) con el enfoque de suma de posiciones aplicado en este estudio para calificar la preferencia del fosfoaceptor Ser/Thr.

a, Abajo, preferencias relativas por los residuos fosfoaceptores de Ser o Thr para cada quinasa, ordenados en orden de selectividad de Ser/Thr decreciente. Arriba, frecuencia de aminoácidos en las posiciones DGF+1 de las quinasas correspondientes (tamaño del contenedor: 15 quinasas). b, Ilustración estructural de la proximidad entre el residuo DFG+1 y el residuo fosfoaceptor del sustrato, que se muestra con el dominio quinasa AKT1 unido al péptido sustrato (GSK3β) (pdb 1O6K).

a, Distribuciones de puntuación percentil de sustratos para sus quinasas anotadas en la literatura (AUCDF = área bajo la función de distribución acumulativa). b, Puntuación percentil de los pares quinasa-sustrato anotados en la literatura en función del número de informes. Un mayor número de informes se correlaciona con puntuaciones percentiles más favorables entre la quinasa informada y su sustrato. n = 9073, n = 3945, n = 544, n = 224 y n = 201 para relaciones quinasa-sustrato con 1, 2, 3, 4 y 5 o más informes, respectivamente. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney de doble cara. Mínimos de caja = percentil 25, centro = percentil 50, máximos = percentil 75. Los bigotes se extienden desde los máximos o mínimos de la caja hasta el valor más grande o más pequeño no más de 1,5 x rango intercuartil. (ns p > 0,05, * p ≤ 0,05, ** p ≤ 10−3, *** p ≤ 10−4, **** p ≤ 10−5).

a, Distribuciones de rango de quinasas para sus sustratos anotados en la literatura (AUCDF = área bajo la función de distribución acumulativa). b, Clasificación de los pares quinasa-sustrato anotados en la literatura, en función del número de informes. Un mayor número de informes se correlaciona con una clasificación más favorable de la quinasa informada para su sustrato. n = 9073, n = 3945, n = 544, n = 224 y n = 201 para relaciones quinasa-sustrato con 1, 2, 3, 4 y 5 o más informes, respectivamente. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney de doble cara. Mínimos de caja = percentil 25, centro = percentil 50, máximos = percentil 75. Los bigotes se extienden desde los máximos o mínimos de la caja hasta el valor más grande o más pequeño no más de 1,5 x rango intercuartil. (ns p > 0,05, * p ≤ 0,05, ** p ≤ 10−3, *** p ≤ 10−4, **** p ≤ 10−5).

a, Ilustración de la regulación localizada en las mitocondrias del complejo piruvato deshidrogenasa mediante la fosforilación por las PDHK. Resultados de puntuación para PDHA1 Ser293, destacando las quinasas de la familia PDHK. b, Ilustración de la fosforilación impulsada por el acoplamiento de ERK1/2 por MEK1/2. Resultados de puntuación para ERK1 Thr202 / ERK2 Thr203 (secuencias idénticas), destacando MEK1 y MEK2.

Ilustración de la fosforregulación de la CTD de la ARN polimerasa II (POLR2A) y la proteína del retinoblastoma (Rb) mediante sus respectivas CDK canónicas, las CDK transcripcionales (púrpura) y las CDK de progresión del ciclo celular (verde) (izquierda). Los vínculos entre quinasas y sustratos corresponden a puntuaciones favorables entre motivos y sitios de fosforilación (derecha).

Higos suplementarios. 1 y 2 y Notas complementarias 1 y 2.

Perfilado de la especificidad del sustrato de la quinasa Ser/Thr. Detalles experimentales para la obtención y perfilado de las quinasas Ser/Thr recombinantes en este estudio.

Datos PSPA y PSSM. Densitometrías crudas obtenidas de experimentos de PSPA y sus formas normalizadas.

Anotación del fosfoproteoma Ser/Thr humano. Un total de 89.752 sitios de fosforilación de Ser y Thr identificados experimentalmente fueron puntuados por 303 PSSM de quinasa Ser/Thr. La tabla permite ordenar los sustratos por puntuaciones percentiles o rangos para quinasas determinadas o por índices de promiscuidad (el número de quinasas con puntuaciones superiores al percentil 90) o puntuaciones percentiles medianas (Fig. 3d).

Análisis de enriquecimiento de motivos con ATM. Los sitios de fosforilación de serina y treonina aumentaron después del tratamiento con radiación ionizante (Fig. 4e), donde ATM se ubicó entre las 15 mejores de 303 quinasas predichas.

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Reimpresiones y permisos

Johnson, JL, Yaron, TM, Huntsman, EM et al. Un atlas de especificidades de sustrato para el kinoma de serina/treonina humana. Naturaleza 613, 759–766 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05575-3

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Recibido: 01 de mayo de 2022

Aceptado: 17 de noviembre de 2022

Publicado: 11 de enero de 2023

Fecha de emisión: 26 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05575-3

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