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May 14, 2024

Las lipoproteínas del líquido cefalorraquídeo inhiben α

Molecular Neurodegeneración volumen 18, Número de artículo: 20 (2023) Cite este artículo 1885 Accesos 3 Citas 21 Detalles de Altmetric Metrics La agregación de α-sinucleína (α-syn) es una característica destacada de

Neurodegeneración molecular volumen 18, número de artículo: 20 (2023) Citar este artículo

1885 Accesos

3 citas

21 altmétrica

Detalles de métricas

La agregación de α-sinucleína (α-syn) es una característica destacada de la enfermedad de Parkinson (EP) y otras sinucleinopatías. Actualmente, los ensayos de amplificación de semillas (SAA) de α-syn que utilizan líquido cefalorraquídeo (LCR) representan las herramientas de diagnóstico más prometedoras para las sinucleinopatías. Sin embargo, el propio LCR contiene varios compuestos que pueden modular la agregación de α-syn de una manera dependiente del paciente, lo que potencialmente socava los SAA de α-syn no optimizados y previene la cuantificación de semillas.

En este estudio, caracterizamos el efecto inhibidor del medio del LCR en la detección de agregados α-syn mediante fraccionamiento del LCR, espectrometría de masas, inmunoensayos, microscopía electrónica de transmisión, espectroscopia de resonancia magnética nuclear en solución, un SAA de diagnóstico estandarizado y de alta precisión, y diferentes Condiciones de agregación in vitro para evaluar la agregación espontánea de α-syn.

Descubrimos que la fracción de alto peso molecular del LCR (> 100.000 Da) es altamente inhibidora de la agregación α-syn e identificamos que las lipoproteínas son los principales impulsores de este efecto. La interacción directa entre las lipoproteínas y el α-syn monomérico no se detectó mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear en solución; por otro lado, observamos complejos de lipoproteína-α-syn mediante microscopía electrónica de transmisión. Estas observaciones son compatibles con la hipótesis de una interacción entre las lipoproteínas y los intermediarios α-syn oligoméricos/protofibrilares. Observamos una amplificación significativamente más lenta de semillas α-syn en PD CSF cuando se agregaron lipoproteínas a la mezcla de reacción de SAA de diagnóstico. Además, observamos una disminución de la capacidad de inhibición del LCR en la agregación de α-syn después de inmunodepletar ApoA1 y ApoE. Finalmente, observamos que los niveles de ApoA1 y ApoE en el LCR se correlacionaban significativamente con los parámetros cinéticos de SAA en n = 31 muestras de LCR de control negativo para SAA enriquecidas con agregados α-syn preformados.

Nuestros resultados describen una nueva interacción entre las lipoproteínas y los agregados de α-syn que inhibe la formación de fibrillas de α-syn y podría tener implicaciones relevantes. De hecho, la inhibición específica del donante del LCR en la agregación α-syn explica la falta de resultados cuantitativos del análisis de los parámetros cinéticos derivados de SAA hasta la fecha. Además, nuestros datos muestran que las lipoproteínas son los principales componentes inhibidores del LCR, lo que sugiere que las mediciones de la concentración de lipoproteínas podrían incorporarse en modelos de análisis de datos para eliminar los efectos de confusión del entorno del LCR en los esfuerzos de cuantificación de α-syn.

La enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA) son enfermedades neurodegenerativas caracterizadas patológicamente por la presencia de inclusiones α-syn intracelulares en regiones cerebrales vulnerables y se denominan comúnmente sinucleinopatías. Los ensayos de amplificación de semillas (SAA), conocidos como amplificación cíclica de plegamiento incorrecto de proteínas (PMCA) [1] y conversión inducida por temblores en tiempo real (RT-QuIC) [2] en el campo de los priones, se han adaptado recientemente para detectar agregados α-syn. en fluidos y tejidos biológicos humanos y puede mejorar significativamente el diagnóstico de sinucleinopatías en un futuro próximo. Los SAA se basan en la amplificación de cantidades diminutas de agregados α-syn similares a priones (semillas α-syn) presentes en matrices biológicas, que se propagan in vitro mediante el reclutamiento de monómeros α-syn recombinantes añadidos a través de ciclos de elongación y fragmentación [3, 4 ]. El proceso de amplificación se controla utilizando tioflavina-T (ThT), un tinte fluorescente que se une con alta afinidad a los motivos de lámina β cruzada de los agregados de amiloide. Sorprendentemente, los SAA han detectado semillas de α-syn en el LCR de casos prodrómicos de EP [5, 6], alcanzando una sensibilidad similar a la de pacientes con enfermedad en toda regla [7,8,9]. Los informes iniciales mostraron correlaciones entre la velocidad de agregación y la progresión de la enfermedad (puntuación H&Y) [1] y los niveles de agregados α-syn sintéticos añadidos en el LCR [1, 7]. Sin embargo, estos resultados no se replicaron al analizar cohortes más grandes [9, 10] y la semicuantificación mediante diluciones en serie tampoco se correlacionó con la progresión de la enfermedad [7, 9]. Se ha observado que el LCR tanto de controles sanos (HC) como de casos de sinucleinopatía inhibe la agregación de α-syn en comparación con el único tampón [1, 11, 12, 13]. Como resultado, los protocolos de SAA incluyen la dilución del LCR para superar la inhibición y permitir una amplificación eficiente de las semillas α-syn [2, 11]. Este efecto se ha observado repetidamente pero, sorprendentemente, aún no se ha caracterizado. De hecho, los efectos del LCR sobre la agregación de α-syn pueden explicar la aparente falta de correlación entre los parámetros del ensayo con la progresión de la enfermedad y la carga de α-syn [9, 10].

En este trabajo, caracterizamos exhaustivamente el efecto inhibidor del LCR sobre la agregación α-syn: primero identificamos una fracción de LCR de alto peso molecular (HMW) que ejerce la mayor parte del efecto inhibidor. Posteriormente, seleccionamos supuestos inhibidores en función de su abundancia relativa en la fracción HMW del LCR y analizamos específicamente sus interacciones con α-syn, su efecto sobre la agregación de α-syn y su posible impacto sobre los SAA de α-syn.

En el trabajo actual, caracterizamos exhaustivamente el efecto inhibidor del LCR humano sobre la agregación de α-syn mediante varias técnicas complementarias. El diseño del estudio del presente trabajo se resume en la Fig. 1. Al principio, recopilamos más evidencia que respalda el hecho de que el LCR es naturalmente capaz de inhibir la agregación de α-syn tanto en la mezcla de reacción de SAA como en la solución salina tamponada con fosfato (PBS), ambos en condiciones sembradas y no sembradas, y de manera dependiente del paciente (Fig. 1A.1). A partir de la observación de que dos muestras de LCR recolectadas de pacientes con hidrocefalia de presión normal (NPH) con una marcada diferencia en el contenido de proteínas produjeron diferentes perfiles de fluorescencia de ThT α-syn en PBS (Fig. 1A.2), realizamos el fraccionamiento de un conjunto de LCR. recolectados de controles neurológicos mediante filtros centrífugos (Fig. 1B.1). Luego analizamos diferentes fracciones mediante espectrometría de masas y ensayos de agregación de proteínas (Fig. 1B.2-3). Determinamos que la fracción correspondiente a un peso molecular superior a 100 kDa, rica en apolipoproteínas, albúmina y transtiretina (TTR), retuvo la mayor parte del efecto inhibidor del LCR puro. Mediante ensayos de agregación de proteínas, Western blot (WB), dot blot (DB), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) en solución determinamos que las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL y LDL) ) son altamente inhibidores contra la agregación de α-syn y probablemente interactúan con especies oligoméricas de α-syn (Fig. 1.C.1-3). Posteriormente, probamos el impacto de concentraciones variables (dentro de rangos fisiológicos) de albúmina, TTR, HDL y LDL en el diagnóstico ultrasensible de SAA (Fig. 1C.4). Luego utilizamos inmunoprecipitación (IP) para agotar las dos apolipoproteínas del LCR más abundantes (ApoA1 y ApoE) de un conjunto de LCR recién creado y probamos el efecto con ensayos de agregación de proteínas (Fig. 1D.1). Finalmente, medimos el contenido de proteína total, las concentraciones de ApoA1 y ApoE en muestras de LCR negativas para SAA de una pequeña cohorte de controles neurológicos y repetimos SAA en las mismas muestras enriquecidas con agregados preformados para evaluar la posible correlación entre los parámetros cinéticos de SAA y el contenido de proteína total en LCR. Concentraciones de ApoA1 y ApoE (Fig. 1D.2).

Escherichia coli BL21 (DE3) Gold se transformó con un vector pT7-7 clonado con el gen que codifica α-syn. El precultivo nocturno de células transformadas se diluyó 100 veces en medio LB y se indujo a un valor de DO600 de 0,6 a 0,8 con isopropil-β-d-tiogalactósido 1 mM; Después de 5 h de incubación a 37 °C, las células se recogieron a 4000 rpm (JA-10, Beckman Coulter). La extracción se realizó mediante choque osmótico utilizando 100 mL del tampón Tris 30 mM, EDTA 2 mM y sacarosa 40%, a pH 7,2, según Shevchik et al. [14] y Huang et al. [15].

Luego, la suspensión se ultracentrifugó a 20 000 rpm (rotor Tipo 70 Ti, Beckman Coulter) durante 25 minutos, y el sedimento se recogió y se resuspendió con 90 ml de agua ultrapura preenfriada que contenía 38 µl de MgCl2 1 M y luego se ultracentrifugó a segunda vez. Los sobrenadantes derivados de estas dos etapas de centrifugación se combinaron y dializaron frente a 4 litros de tampón Tris/HCl 20 mM a pH 8,0. Luego, la proteína se cargó en el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápidas y se llevó a cabo una cromatografía de intercambio aniónico con NaCl 1 M de gradiente lineal del 0 al 50 % (columna GE Healthcare HiPrep Q HP 16/10). Las fracciones recogidas se liofilizaron y se resuspendieron en Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM y urea 8 M a pH 8,0 para desnaturalización química. Para eliminar toda la proteína que formaba agregados, se realizaron dos cromatografías de exclusión por tamaño (columna HiLoad 16/600 Superdex de 75 pg) con fosfato 20 mM y EDTA 0,5 mM a pH 8,0 como tampón de elución. El α-syn purificado se dializó frente a agua Milli-Q y se liofilizó en lotes para su almacenamiento a largo plazo. El cóctel inhibidor de proteasa completo de Roche se añadió sólo durante el paso de extracción en la cantidad sugerida por el productor.

Se expresó α-syn de tipo salvaje marcado con 15N en Escherichia coli cultivada en medio mínimo M9 suplementado con 15NH4Cl y se purificó como se inició para E. coli en medio LB.

Para α-syn marcado y no marcado con 15N, la expresión y purificación de proteínas se realizaron como se describió anteriormente [16]. Se utilizaron RMN en solución 1H, electroforesis en gel y tinción con plata para comprobar la calidad de la proteína purificada. En la Fig. S1 (Material complementario) se muestra una imagen de dos experimentos replicados de tinción con plata realizados en el α-syn purificado después de uno y dos (utilizados en ensayos de agregación de proteínas) pasos de cromatografía de exclusión por tamaño.

Para TTR, se transformaron células Escherichia coli BL21(DE3) RIPL PLysS con el plásmido pET-28a(+) que codifica el gen TTR. Las células se cultivaron en medio LB que contenía 0,1 mg/ml de kanamicina, se cultivaron a 37 °C, hasta que la DO600 alcanzó 0,6–0,8 y luego se indujeron con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM. Se cultivaron adicionalmente a 37 °C durante la noche y luego se recogieron mediante centrifugación a 6500 rpm (JA-10 Beckman Coulter) durante 15 minutos a 4 °C. El sedimento se suspendió en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5 (60 ml por litro de cultivo) y se sonicó a 4 °C durante 40 min. La suspensión se centrifugó a 40.000 rpm (F15-6 × 100y Thermo Scientific) durante 40 minutos y se descartó el sedimento. La TTR se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna HiPrep Q FF 16/10 (GE Healthcare Life Science). La proteína se eluyó en tampón Tris-HCl 20 mM a pH 8,6 con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M. Las fracciones que contenían TTR pura se identificaron mediante tinción con Coomassie en geles SDS-PAGE, luego se unieron y se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando HiLoad Superdex 26/60 75 pg en tampón fosfato 50 mM a pH 7,5.

Las muestras de LCR de control neurológico (NC) utilizadas en este trabajo se recolectaron y almacenaron previamente a -80 °C de acuerdo con las pautas internacionales [17]. NC fueron sujetos sin deterioro cognitivo remitidos al Centro de Trastornos de la Memoria de la Universidad de Perugia (Perugia, Italia), a quienes se les realizó una punción lumbar por problemas de memoria subjetiva no confirmados por la evaluación neuropsicológica, o como parte de un estudio diagnóstico por problemas neurológicos menores. síntomas (es decir, dolor de cabeza, neuropatía periférica, trastornos psiquiátricos), que no muestren deterioro cognitivo después de al menos un seguimiento de 2 años. Todas las muestras de NC seleccionadas dieron negativo tanto para los biomarcadores clásicos de AD CSF (proporción de péptidos amiloide 1–40 y 1–42, tau total y tau fosforilada T181) [18] como para α-syn SAA [19].

Se agruparon LCR de 19 sujetos diferentes de NC (10 mujeres y 9 hombres, edad promedio = 70 años, desviación estándar = 8 años) (grupo 1 de LCR) alcanzando un volumen total de 8 ml que se dividió en 2 alícuotas de 3 ml y 10 alícuotas de 0,2 mL.

Se preparó un segundo grupo de LCR de 5 ml a partir de diferentes muestras de LCR recolectadas de n = 10 sujetos NC (5 mujeres y 5 hombres, edad promedio = 69 años, desviación estándar = 5 años). Luego, este segundo grupo se dividió en 10 alícuotas de 0,5 ml cada una, que luego se usaron para experimentos de inmunodepleción de ApoA1 y ApoE y ensayos de agregación de proteínas.

Se seleccionaron dos alícuotas de 0,5 ml en relación con 31 muestras de LCR recolectadas de sujetos de Carolina del Norte (7 mujeres y 24 hombres, edad promedio = 69 años, desviación estándar = 8 años) para los ELISA de ApoA1 y ApoE, la medición de proteína total y los experimentos de SAA.

Se utilizó LCR recolectado de sujetos sanos de control (HC) y con EP para realizar experimentos iniciales de adición de semillas de α-syn y para probar el impacto de agregar HDL, LDL, HSA y TTR en Amprion Inc. (San Diego, CA, EE. UU.). Las muestras de HC1-6 utilizadas en los experimentos de adición de semillas de α-syn que se muestran en la Fig. 2A se compraron en Biochemed Services (Winchester, VA, EE. UU.) y se recolectaron de 3 hombres y 3 mujeres (edad = 26–39 años). Con referencia a los experimentos resumidos en la Fig. 8, HC22 (mujer, edad = 35 años) y HC24, HC66, HC67 (todos hombres, edad = 30–35 años) también se compraron de Biochemed Services. Todas las muestras puras de LCR con HC dieron negativo en α-syn SAA. Con referencia a los mismos experimentos, las muestras de LCR PD10, PD34, PD62 (todos hombres, edad = 72–79) pertenecían a pacientes con EP con un estadio Hoehn y Yahr (H&Y) de 2 y se compraron en PrecisionMed (Carlsbad, CA, EE. UU. ). PD47 (paciente con EP, mujer, edad = 62 años, H&Y = 1,5) se compró en BioIVT (Westbury, NY, EE. UU.). Todas las muestras de LCR con PD puras dieron positivo en α-syn SAA.

Se resuspendió una alícuota de 3 ml del conjunto 1 de LCR en 1,5 ml de PBS 3x para tener 4,5 ml de LCR humano combinado en PBS 1x. Luego, este volumen se sometió a una serie de filtraciones utilizando filtros de corte de peso molecular (MWCO) Amicon® Ultra-4. El procedimiento utilizado para fraccionar el LCR humano se esquematiza en la Fig. 4A. Las alícuotas recolectadas de esta manera contenían los diferentes constituyentes de los 4,5 ml iniciales de LCR en PBS con diferentes factores de concentración; el volumen y los factores de concentración relativos (con respecto a la fracción 1) de las alícuotas representadas en la Fig. 4A se resumen en la Tabla S1. Las alícuotas 2, 3, 4 y 5 se lavaron 3 veces con PBS antes del almacenamiento. Luego se probó la capacidad de interactuar con monómeros α-syn para todas las fracciones del LCR. Los diferentes factores de concentración se ajustaron diluyendo las muestras con PBS (consulte la Tabla de material complementario S1).

Se generaron agregados de α-syn preformados incubando 1 mg/ml de α-syn en PBS durante una semana a 37 °C bajo agitación orbital doble vigorosa (500 rpm) en un vial de polipropileno sellado de 1,5 ml. Los productos finales se sometieron a ciclos de sonicación (20 s de sonicación con la punta, 20 s de descanso) con una amplitud de 12 μm. El vial de polipropileno se sumergió en hielo durante todo el procedimiento de sonicación. Luego los agregados se diluyeron a 0,25, 2,5, 25, 250 y 2500 pg/μL, considerando como referencia la concentración inicial de monómero. Luego, los agregados α-syn generados se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

Las muestras se analizaron como se informó anteriormente [19, 20]. Brevemente, las muestras de LCR se evaluaron por triplicado (40 µL/pocillo) en una placa de 96 pocillos (COSTAR 96, cat# 3916), en una mezcla de reacción que consta de 0,3 mg/mL de α-syn recombinante (Amprion, cat# S2020), TUBOS 100 mM pH 6,50 (Sigma, cat# 80,635), NaCl 500 mM (Lonza, cat# 51,202), ThT 10 µM (Sigma, cat# T3516) y una perla de Si3N4 bloqueada con BSA de 3/32 de pulgada (Tsubaki Nakashima ). Las perlas se bloquearon con BSA al 1 % en PIPES 100 mM, pH 6,50, durante 1 h, se lavaron dos veces con PIPES 100 mM, pH 6,50, y se secaron durante la noche. Este ensayo se realizó en un agitador/lector BMG FLUOstar Omega a 37 °C, las placas se agitaron durante 60 s cada 30 min durante 150 h. Los resultados del ensayo son positivos, no concluyentes o negativos, según un algoritmo probabilístico que utiliza parámetros cinéticos y de fluorescencia máxima [19]. Con respecto a otros ensayos de agregación de proteínas realizados en este trabajo, el SAA de diagnóstico ultrasensible utilizó un sustrato αSyn diferente (histag C-terminal), que se purificó mediante procedimientos IMAC estándar (Amprion, cat#S2020) [19, 20].

Los experimentos de agregación de proteínas utilizados para caracterizar la interacción entre α-syn y los constituyentes del LCR se realizaron con un fluorómetro BMG LABTECH ClarioStar® programable en placas Greiner de 96 pocillos de fondo transparente (n.º de catálogo 655,906). La fluorescencia de ThT se leyó desde abajo utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 450 y 480 nm, respectivamente. Para todos los experimentos se utilizó una temperatura de incubación de 37 °C. Se utilizaron valores de ganancia ligeramente diferentes para evitar el desbordamiento del convertidor analógico a digital. En cada experimento, se descongeló α-syn recombinante liofilizado en NaOH 3 mM a una concentración de 3,5 mg/ml. La solución se llevó a pH fisiológico diluyéndola con PBS concentrado (4x) y agua destilada. En todos los experimentos descritos, el volumen de reacción final fue de 200 μL, la concentración final de α-syn fue de 0,7 mg/mL y la concentración final de ThT fue de 10 μM. Para evitar la contaminación bacteriana, también estuvo presente un 0,1% de NaN3 en todas las condiciones analizadas. Todas las reacciones se realizaron a 37 °C en placas selladas. Cada condición se probó al menos por triplicado.

Se vertieron 158 µL de la solución que contenía α-syn monomérico en pocillos, cada uno de los cuales contenía 6 perlas de vidrio de 1 mm de diámetro. Dependiendo del experimento, se agregaron 40 µl de LCR humano combinado/NPH, 40 µl de PBS o 40 µl de fracciones de LCR. En experimentos sembrados, se agregaron 2 μL de PBS que contenía 0, 0,25, 2,5, 25, 250 y 2500 pg/μL de agregados α-syn. Las placas se sellaron y se sometieron a ciclos de agitación (1 min de agitación doble orbital a 500 rpm, 14 min de reposo) dentro del fluorómetro.

Para comparar los resultados con los de un artículo publicado anteriormente, el experimento se realizó exactamente de la misma manera que se describe en Bellomo et al. [dieciséis]. Con respecto a los experimentos descritos anteriormente la única diferencia notable consistió en aplicar un protocolo de agitación/incubación de 29 min de reposo y 1 min de agitación. Además de HSA (Sigma Aldrich, A1653), también se analizaron pocillos que contenían 0,12 mg/ml y 0,57 mg/ml de HDL en suero humano (Sigma Aldrich, LP3) con y sin α-syn.

En estos experimentos se agregaron 40 μL de soluciones que contenían diferentes diluciones (todos los productos se diluyeron con H2O destilada) de HDL de suero humano (Sigma-Aldrich LP3), LDL de suero humano (Sigma-Aldrich LP2) y TTR recombinante. Cada condición se replicó en 3 pocillos distintos en presencia y ausencia de α-syn. Para los experimentos en los que probamos el efecto de diferentes concentraciones de HDL en suero humano (0, 0,003, 0,03, 0,3 y 1 mg/mL) la placa se selló y se sometió a ciclos de 1 min de agitación doble orbital a 500 rpm, 14 descanso mínimo. Para los experimentos en los que probamos el efecto de diferentes concentraciones de HDL (0,3 mg/mL), LDL (0,03 y 0,3 mg/mL) y TTR (1,0, 0,3 y 0,03 mg/mL) en suero humano, se cambió el protocolo de agitación a 2 min de agitación doble orbital a 500 rpm y 13 min de reposo a 37 °C.

Durante los experimentos de SAA ultrasensibles realizados en Amprion Inc., se recogieron lecturas de fluorescencia cada 30 minutos para estimar los parámetros cinéticos con alta precisión. Se utilizó el siguiente sigmoide de 4 parámetros para ajustar las lecturas de fluorescencia sin procesar:

donde Fmin es la fluorescencia mínima, Fmax es la fluorescencia máxima, T50 es el tiempo para alcanzar el 50% de Fmax, S es la pendiente y t es el tiempo. Para cada ajuste se calculó el coeficiente de determinación (R2). El resultado de α-syn SAA de cada muestra de LCR se determinó mediante un algoritmo probabilístico:

donde Ppos es la probabilidad de que una réplica sea positiva, A = -4,02, B = 2,98, C = 1,87 y Fmax5000 y Rsquare93 son valores binarios que dependen de un umbral. Si el Fmax de una réplica determinada está por encima de 5000 RFU, entonces Fmax5000 = 1, en caso contrario 0. Si el R2 para el ajuste del modelo de 4 parámetros a los datos de fluorescencia está por encima de 0,93, entonces Rsquare93 = 1, en caso contrario 0. Los coeficientes A, B y C se estimaron utilizando una base de datos de más de 900 curvas de agregación. Entre las muestras de PD y HC en la base de datos, Fmax y R2 mostraron diferencias estadísticamente significativas (valor de p <0,001 para cada una de estas variables). Si la probabilidad de positividad (Ppos) es superior a 0,12, la réplica se determina positiva; de lo contrario, se determina negativa. Dado que las muestras de LCR se analizaron por triplicado, si las 3 réplicas eran positivas, la muestra de LCR se consideró positiva. Si ninguna o una réplica fue positiva, la muestra de LCR se consideró negativa. Si dos réplicas eran positivas y el Fmax promedio de las 3 réplicas era inferior a 5000 RFU (o au) o el coeficiente de variación (CV) era superior a 110, la muestra también se consideraba negativa.

La fluorescencia de fondo promedio producida por tres pocillos que contienen el analito sin α-syn se restó antes del análisis de los perfiles de intensidad de ThT en relación con el mismo analito en presencia de α-syn. Mientras se analizaban los datos relativos al único α-syn, se restó la fluorescencia de fondo del pocillo que contenía solo el tampón de reacción. Luego, a cada traza cinética de ThT se le asignó una función sigmoidea doble utilizando Origin Pro v9.0. En el modelo de ajuste, A2 se ajusta al valor de fluorescencia de la segunda meseta, A1 se ajusta al valor de fluorescencia de la primera meseta y A0 se ajusta a la fluorescencia inicial. Los parámetros de tiempo t1 y t2 se ajustan al primer y segundo punto de inflexión, respectivamente, mientras que d1 y d2 representan las pendientes de los sigmoideos. En el procedimiento de ajuste no lineal utilizado, se aplicaron los siguientes límites: 0 < A0 < 1000, 500 < A1 < 5000, A2 > 2000, 0 < t1 < 100 h y t2 > 0. Para algunas trazas cinéticas, una disminución en Se observó fluorescencia después de alcanzar la segunda meseta. Este conocido fenómeno es causado por el secuestro de moléculas de ThT por fibrillas maduras y por la sedimentación de agregados insolubles de HMW [21]. En estos casos, la última parte descendente del perfil ThT se eliminó antes de su montaje. El ajuste se rechazó cuando el coeficiente de determinación ajustado R2 fue inferior a 0,3.

Se agregaron cantidades iguales de productos de ensayo (volúmenes que contenían 2 µg de α-syn) con tampón de muestra de Laemmli sin dodecilsulfato de sodio (SDS), sin hervirlos para evitar la solubilización de agregados sensibles al SDS. Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 4-20 % (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de PVDF (0,45 μm, Bio-Rad) mediante transferencia húmeda a 100 V constante durante 90 min usando Tris-HCl 25 mM, 192 Glicina mM, 20% de metanol y 0,015% de SDS. Las membranas se fijaron con PFA al 4% durante 30 minutos antes de bloquearlas con leche desnatada al 5% en TBS-T (TBS con Tween 20 al 0,1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, los filtros se incubaron con anticuerpo primario contra α-syn (211, sc-12767, Santa Cruz Biotechnology) O/N a 4 °C. Las membranas se incubaron adicionalmente con un anticuerpo secundario conjugado IgG-HRP de cabra-anti-ratón (Bio-Rad, 1.706.516; 1:5000) durante 1 hora a temperatura ambiente, y las señales se visualizaron mediante una reacción ECL. El análisis densitométrico se realizó con el software ImageJ (Instituto Nacional de Salud). Las imágenes de transferencia de puntos se invirtieron y se ajustó la ventana/nivel antes del análisis. Se utilizó una región de interés rectangular (ROI) para medir la intensidad promedio del nivel de gris en cada banda en relación con el α-syn monomérico. Posteriormente se restó el nivel de gris promedio de una ROI equivalente que no contenía bandas. Para estimar el porcentaje aproximado de monómero α-syn restante, la intensidad promedio de las bandas de WB se dividió por la de t = 1 h.

Para la transferencia puntual, se mancharon alícuotas de productos obtenidos en SAA correspondientes a 300 ng de α-syn monomérico en las mezclas de reacción iniciales (2 μL/punto) en una membrana de nitrocelulosa preequilibrada con TBS-T. Las muestras se secaron a temperatura ambiente y se fijaron con PFA (0,4% en PBS) durante 30 minutos, y luego los filtros se bloquearon con leche descremada al 2% (en TBS-T). Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos conformacionales OC (1:1000) o A11 (1:1000) [22] seguido de incubación con conjugado IgG-HRP de cabra-anti-conejo (1:5000; 1,706,515 Bio-Rad ) anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se revelaron con una reacción ECL y las imágenes se adquirieron mediante un sistema de imágenes ChemiDoc™. Las imágenes de transferencia de puntos se invirtieron y se ajustó la ventana/nivel antes del análisis. La intensidad promedio del nivel de gris se extrajo de una ROI circular que contenía todas las muestras que contenían α-syn. Para cada punto, se restó la intensidad del nivel de gris promedio de una ROI adyacente que no contenía ningún punto para eliminar la intensidad del fondo. Luego, la intensidad del nivel de gris promediada y restada del fondo se multiplicó por el área de ROI en cm2 para estimar la densidad integrada. No se encontraron fluctuaciones significativas en el nivel de gris al repetir el mismo procedimiento para muestras de control que no contenían α-syn.

Se realizó inmunoprecipitación (IP) para agotar ApoA1 y ApoE de la muestra combinada de LCR. Se combinaron 50 µl de proteína A/G inmovilizada sedimentada (100 µl de suspensión de resina, Pierce™ Protein A/G Plus Agarose, ThermoFisher Scientific™, EE. UU.) y 60 µg de anticuerpo anti-ApoA1 (MIA1404, ThermoFisher Scientific™, EE. UU.). un tubo de 2 ml. La suspensión de perlas y anticuerpos se incubó durante 4 horas a 4 °C (rotación constante). El tubo se centrifugó a 1000 xg durante 2 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El sedimento de perlas se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). De manera similar, se agregaron 50 µl de proteína A/G inmovilizada sedimentada (100 µl de suspensión de resina, Pierce™ Protein A/G Plus Agarose, ThermoFisher Scientific™, EE. UU.) y 20 µg de anticuerpo anti-ApoE (PA5-27,088, ThermoFisher Scientific™, EE. UU. ) se combinaron en un tubo de 2 ml. La suspensión de perlas y anticuerpos se incubó durante 4 horas a 4 °C (rotación constante). El tubo se centrifugó a 1000 xg durante 2 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El sedimento de perlas se lavó dos veces con PBS. Posteriormente, se combinaron perlas unidas al anticuerpo ApoA1 y perlas unidas al anticuerpo ApoE en un único tubo de 2 ml. La solución se mezcló suavemente y se centrifugó a 1000 x g durante 2 minutos a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 400 µl del conjunto de LCR al tubo con perlas. La muestra se sometió a incubación durante la noche a 4 °C (rotación constante). Al final de la incubación, la suspensión de perlas de LCR se centrifugó (1000 x g durante 2 minutos a 4 ° C) y el sobrenadante y el sedimento de perlas se recogieron por separado para su posterior análisis. Paralelamente, se preparó una muestra de control siguiendo el mismo procedimiento en perlas sin anticuerpo anti-ApoA1 o anti-ApoE unido a IP. Brevemente, se transfirieron 50 µl de suspensión de resina pura a un tubo de 2 ml y se lavaron con PBS dos veces. Después del segundo ciclo de lavado, se eliminó el PBS y en su lugar se agregaron 400 µl de mezcla de LCR. La muestra se sometió a incubación durante la noche a 4 °C (rotación constante). Al final de la incubación, la muestra se centrifugó (1000 x g durante 2 minutos a 4 ° C) y el sobrenadante y el sedimento de perlas se recogieron por separado para su posterior análisis. El rendimiento de ApoA1 y ApoE IP se evaluó mediante Western Blot. Brevemente, todas las muestras (1. muestra combinada de LCR de IP, 2. muestra combinada de LCR que se somete a un procedimiento que imita a IP (sin anticuerpo), 3. gránulo de perlas de una muestra combinada de LCR de IP, 4. gránulo de cuentas de una muestra combinada de LCR que se somete a un procedimiento que imita a IP ( sin anticuerpo), 5. muestra combinada de LCR pura que no se sometió a ningún tratamiento) se resuspendieron en un tampón de carga reductor y se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C (termobloque). Se centrifugaron los tubos con sedimento de perlas (muestras 3 y 4) y se recogió el sobrenadante y se utilizó para análisis posteriores. Se preparó un gel de poliacrilamida al 12% y las muestras se procesaron en condiciones reductoras. Todas las muestras se transfirieron del gel a una membrana de transferencia de nitrocelulosa (SF110B, Himedia, India). La calidad de la transferencia se evaluó mediante la tinción reversible de Ponceau S. La membrana se bloqueó y posteriormente se sondeó durante la noche a 4 °C (agitador) con los anticuerpos primarios seleccionados (MIA1404 para ApoA1, PA5-27,088 para ApoE, 1:1000) diluidos en albúmina sérica bovina (BSA) al 5%, NaN3 al 0,02% en Solución salina tamponada con Tris con Tween®20 al 0,1% (Sigma-Aldrich, EE. UU.) (TBST) con adición de rojo de fenol como indicador de pH. Después de la incubación, la membrana se lavó con TBST y los anticuerpos secundarios diluidos 1:5000 en un tampón de bloqueo se aplicaron durante 1 h a temperatura ambiente. Dependiendo de los anticuerpos primarios utilizados, se pueden utilizar anticuerpos anti-ratón de cabra (170–6516, Bio-Rad, EE. UU.) (para MIA1404) o IgG-HRP anti-conejo de cabra (170–6515, Bio-Rad, EE. UU.) (para PA5-27,088 ) fueron agregados. El desarrollo de la señal se realizó con el uso de la solución de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (SuperSignal™ West Pico Plus, ThermoFisher Scientific™, EE. UU.).

Los niveles de ApoA1 y ApoE en el LCR se evaluaron con el uso de kits ELISA disponibles comercialmente: kit ELISA de apolipoproteína AI humana, ab108803 y kit ELISA de apolipoproteína E humana, ab108813 (Abcam, Reino Unido) en n = 31 muestras de LCR NC negativas para SAA. Ambos ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante. Todos los puntos de la curva estándar y las muestras de LCR se analizaron por duplicado. La densidad óptica (OD) se leyó a 450 nm (corrección de longitud de onda 570 nm) mediante el lector de placas Clariostar (BMG Labtech, Alemania). Se aplicó el modelo logístico de 4 parámetros para generar una curva estándar e interpolar concentraciones de muestras de LCR analizadas.

El contenido de proteína total se evaluó en las mismas muestras utilizando el reactivo de ensayo de proteínas de 660 nm Pierce™ cat. 22.660 (Thermo Scientific™, EE.UU.). El ensayo se realizó según el protocolo del fabricante. Un conjunto de diluciones de BSA de concentraciones conocidas sirvió como estándar para calcular el contenido de proteína total de las muestras de LCR. Todos los puntos de la curva estándar y las muestras de LCR se analizaron por duplicado.

Se aplicaron el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones de medias mientras se evaluaban las diferencias entre los parámetros cinéticos ajustados para diferentes muestras. La correlación entre la masa de semillas añadida y los parámetros T2 se calculó según Spearman. Se aplicó la prueba t de Student de dos colas al comparar densidades integradas ajustadas de imágenes de transferencia de puntos. El error estándar de la media (SEM) se informa en cada imagen que muestra gráficos de barras y/o perfiles de fluorescencia promedio. En el análisis de los datos de espectrometría de masas, se impuso una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1 % y el criterio utilizado para aceptar la identificación de proteínas incluyó una puntuación probabilística ordenada por el software. Las correlaciones entre los parámetros de SAA y los niveles de ApoA1, ApoE y proteína total en LCR transformados con Log2 se calcularon mediante los coeficientes de correlación de Pearson. Se aplicó el criterio de vinculación de barrio para la agrupación jerárquica de correlaciones.

Una descripción detallada del diseño del estudio (tipo de experimentos y flujo de trabajo) está presente en la Sección. 2.1 de Material y Métodos y se resume gráficamente en la Fig. 1.

Esquema que resume el pipeline y las técnicas utilizadas en el presente trabajo. Leyenda del icono. TEM: microscopía electrónica de transmisión; ThT: ensayo de agregación de la proteína tioflavina-T; SAA: ensayo de amplificación de semillas de α-sinucleína; RMN 1H: espectroscopia de resonancia magnética de protones en solución; MS: espectrometría de masas; CENTRO. FILTROS: filtros centrífugos; RMN 1H-15N: espectroscopia de resonancia magnética nuclear en solución de protón-nitrógeno 2D; DB: ensayo de transferencia puntual; WB: ensayo de transferencia Western; IP: inmunoprecipitación; ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

La inhibición de la agregación de α-syn en el LCR en SAA sigue estando mal caracterizada, aunque ya se ha informado en la literatura [1, 2, 11, 12]. Agregamos 20 fg de agregados α-syn sintéticos (semillas sintéticas) en el LCR de sujetos de control sanos (HC) para determinar si la inhibición del LCR es similar e intrínseca a todos los LCR o si depende del sujeto. Estas muestras enriquecidas se analizaron en un SAA α-syn de diagnóstico altamente sensible y específico desarrollado por Concha-Marambio et al. [19, 20]. Aunque se sabe que las semillas sintéticas se agregan de una manera muy reproducible cuando se introducen únicamente en tampón, la cinética de agregación fue visiblemente diferente según el donante de LCR (Fig. 2A). En estas condiciones experimentales, la agregación α-syn sembrada presenta una única fase de elongación y una meseta, y el tiempo para alcanzar el 50% de la meseta de fluorescencia (T50) describe la velocidad de la reacción. Los valores de T50 fueron significativamente diferentes entre las diferentes muestras de LCR (p < < 0,001, consulte el material complementario, figura S2). El LCR menos inhibidor (n.° 1) permitió la amplificación de las semillas sintéticas aproximadamente un 50 % más rápido que el LCR más inhibidor (n.° 3) (Material complementario, figura S2). Las muestras de LCR sin semillas sintéticas no mostraron ninguna agregación espontánea según este protocolo. Luego decidimos caracterizar aún más esta inhibición por la fluorescencia de ThT en un ensayo de agregación de proteínas simplificado capaz de resaltar mejor el efecto inhibidor del LCR, incluso sobre la agregación espontánea de α-syn, en un tampón con pH fisiológico y fuerza iónica (PBS). Se añadió un conjunto de muestras de LCR recolectadas de controles neurológicos (NC) a la mezcla de reacción de α-syn/PBS en ausencia de semillas sintéticas para evaluar si la inhibición del LCR podría suprimir la agregación espontánea de α-syn. En estas condiciones experimentales, el LCR bloqueó completamente la agregación espontánea de α-syn (Fig. 2B). Luego comparamos la inhibición del LCR con las reacciones de amplificación de semillas en tampón PBS al agregar diferentes niveles de semillas sintéticas (0,5 pg - 5 ng) y descubrimos que el LCR impedía la agregación de α-syn en las semillas incluso cuando se usaban altas concentraciones de semillas α-syn sintéticas ( 5 ng), mientras que las reacciones sin LCR permitieron una agregación sembrada reproducible en todas las concentraciones probadas (Fig. 2C). Curiosamente, en estas condiciones físico-químicas, tanto la agregación sembrada como la espontánea presentaron dos fases de elongación y dos mesetas (Fig. 2C, recuadro), que podrían describirse mediante una función doble sigmoidal (Fig. 2D). El punto de inflexión de la segunda fase de alargamiento (t2) se estimó mediante un ajuste doble sigmoidal y se correlacionó con la masa logarítmica de semillas sintéticas (Material complementario, Fig. S3), de acuerdo con la literatura previa [1, 12]. Para caracterizar aún más nuestras condiciones experimentales en PBS, analizamos muestras de ambas mesetas de la curva de agregación mediante TEM. En la primera meseta, solo están presentes agregados cortos y parcialmente amorfos, mientras que en la segunda meseta se observa una gran cantidad de estructuras fibrilares (Fig. 2E).

El LCR inhibe la agregación de α-syn en condiciones sembradas y no sembradas de una manera dependiente del paciente. A Seis muestras diferentes de LCR HC humano (40 µL) enriquecidas con 20 fg de fibrillas α-syn sintéticas preformadas (semillas) y analizadas mediante condiciones de diagnóstico SAA: 0,3 mg/mL (19,6 µM) de α-syn recombinante en TUBOS 100 mM pH 6,5 y NaCl 500 mM, volumen final de 200 µL. B Ensayo de agregación de proteínas realizado con 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS con (negro) y sin (rojo) 40 µL de mezcla NC CSF (volumen final de 200 µL). C Ensayo de amplificación de semillas en PBS de diferentes cantidades de semillas sintéticas (0,5, 5, 50, 500 y 5000 pg) con y sin LCR combinado NC (solo se muestran 3 masas de semillas). D Descripción gráfica de la función de ajuste utilizada. A2 se ajusta al valor de fluorescencia de la segunda meseta, A1 se ajusta al valor de fluorescencia de la primera meseta y A0 se ajusta a la fluorescencia inicial. Los parámetros de tiempo t1 y t2 se ajustan al primer y segundo punto de inflexión, respectivamente, mientras que d1 y d2 representan las pendientes de los sigmoideos. E Ensayo de agregación de proteínas realizado con 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS (volumen final de 200 µl). En cada pocillo se añadieron seis perlas de vidrio con un diámetro de 1 mm. El protocolo de agitación/incubación consistió en 1 min de agitación a 500 rpm y 14 min de reposo a 37 °C. El experimento se realizó por quintuplicado; Se usaron tres réplicas para producir el perfil de agregación promedio informado anteriormente, las otras dos réplicas se recolectaron de la placa en t = 35 h y t = 165 h, y se analizaron mediante TEM para producir las imágenes representativas que se muestran en la parte inferior del panel E). . Todos los rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan SEM

El LCR de hidrocefalia de presión normal (NPH) sin deterioro cognitivo generalmente está disponible en grandes volúmenes y a menudo se usa para el desarrollo de ensayos o como controles negativos en SAA de diagnóstico. Aunque se consideran controles negativos debido a la falta de semillas de α-syn detectables, se ha informado que la dilución de los componentes del LCR es común en pacientes con NPH [23], lo que podría tener efectos relevantes sobre la agregación de α-syn. Por lo tanto, evaluamos el efecto del LCR de 2 casos de NPH sobre la agregación espontánea de α-syn, para determinar si replicaron el efecto inhibidor observado con NC-CSF (Fig. 3A). Sorprendentemente, se observó agregación espontánea de α-syn con la muestra de NPH2, pero no con NPH1, lo que confirma dramáticamente que el efecto inhibidor del LCR sobre la agregación de α-syn depende del donante. Además, dado el efecto de dilución descrito para algunos pacientes con NPH, estos resultados indican un efecto inhibidor dependiente de la concentración de algunos componentes del LCR. Para probar cualitativamente esta hipótesis, analizamos el contenido de estas dos muestras de LCR mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de alto campo con solución 1D 1H. Las diferencias más evidentes entre los dos espectros se encuentran entre 1,5 y 0 ppm, donde generalmente se observan resonancias de metilo (Fig. 3B). Curiosamente, algunas especies parecen estar más concentradas en el LCR de NPH1 con respecto a NPH2, siguiendo el patrón de inhibición de la agregación α-syn. A partir de estudios metabolómicos, se sabe que las lipoproteínas ricas en ácidos grasos y/u otras proteínas HMW producen picos amplios similares en los espectros de RMN de solución 1H [24, 25]. La información cualitativa obtenida por 1H NMR se confirmó luego mediante nLC-nESI HRMS/MS. Identificamos aproximadamente 400 y 200 proteínas diferentes en NPH1 y NPH2, respectivamente. La albúmina, las apolipoproteínas y las proteínas del complemento fueron las tres familias de proteínas más abundantes en muestras de LCR puras NPH1 y NPH2. En NPH1 CSF, el contenido de proteína total fue menor en un factor de 2 (un factor de 3 para las apolipoproteínas totales) con respecto al NPH2 CSF (ver Fig. 3C).

Análisis de muestras de LCR NPH. Un ensayo de agregación de proteínas realizado utilizando 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS con 40 µl de LCR de 2 sujetos con NPH (40 µL). Los dos rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan el SEM. B Porción de los espectros de RMN 1D 1H en relación con las dos muestras de LCR de NPH. C Relación de concentración relativa (puntuación emPAI multiplicada por el peso molecular de la proteína) de la proteína total y los tres constituyentes proteicos más abundantes medidos mediante nLC-nESI HRMS/MS en muestras de LCR NPH1 y NPH2 puras. Se detectaron aproximadamente 200 y 400 proteínas diferentes en NPH1 y NPH2, respectivamente. La albúmina fue la proteína más abundante seguida de las apolipoproteínas y las proteínas del complemento. Las puntuaciones de apolipoproteínas se sumaron, siendo ApoA1 y ApoE las más abundantes (~ 85% del total). El complemento C3 y C4 se encontraron como las proteínas del complemento más abundantes (~65% del total)

Después de demostrar que la composición del LCR depende del donante y se correlaciona con la inhibición de la agregación α-syn in vitro, fraccionamos el conjunto de NC-CSF utilizado anteriormente para investigar qué componentes del LCR estaban detrás de este efecto inhibidor. El fraccionamiento se realizó utilizando filtros centrífugos cónicos de corte de peso molecular (MWCO) (para obtener detalles sobre el procedimiento de fraccionamiento y los factores de concentración final, consulte la Fig. 4A y la Tabla S1). Obtuvimos 6 muestras después del fraccionamiento: LCR completo, constituyentes del LCR de peso molecular (PM) superior a 100 kDa (> 100 kDa), constituyentes del LCR de PM entre 100 y 50 kDa (100-50 kDa), constituyentes del LCR de PM entre 50 y 10 kDa (50-10 kDa), constituyentes del LCR de PM entre 10 y 3 kDa (10-3 kDa) y constituyentes del LCR de PM inferior a 3 kDa (< 3 kDa). Luego analizamos el efecto inhibidor de cada una de estas 6 fracciones sobre la agregación espontánea de α-syn en las condiciones de PBS mencionadas anteriormente (es decir, las de las Fig. 2B, C, E). Hubo diferencias claras en la agregación de α-syn dependiendo del PM de la fracción de LCR. El LCR completo y todas las fracciones con PM > 10 kDa inhibieron drásticamente la agregación α-syn, mientras que las fracciones de 10-3 kDa y <3 kDa mostraron una agregación comparable a la reacción sin componentes del LCR (control de PBS) (Fig. 4B). Estimamos la segunda meseta de fluorescencia (A2) utilizando el modelo doble sigmoideo y comparamos los resultados con las lecturas máximas de fluorescencia (Fmax) para las 6 muestras derivadas de LCR (Fig. 4C). Como se esperaba, A2 y Fmax fueron muy similares dentro de cada muestra derivada de LCR, lo que confirma la bondad del ajuste, excepto para el LCR completo y > 100 kDa para el cual no fue posible el ajuste. De hecho, para el LCR completo y > 100 kDa, las lecturas de fluorescencia se mantuvieron prácticamente planas, lo que impidió el ajuste a través del modelo doble sigmoideo. Lo que sugiere una menor inhibición de la agregación α-syn, A2 y Fmax fueron sustancialmente más altos en las fracciones de 10–3 y <3 kDa, que eran comparables al control de PBS. Se observó cierta inhibición en la fracción < 3 kDa, pero esto es probablemente el resultado de un aumento en el pH por la exposición al aire durante el procedimiento de fraccionamiento en lugar de una inhibición de la agregación de α-syn por los componentes proteicos (como se describe en los experimentos de RMN con solución de material suplementario). en fracciones de LCR y Fig. S4-5). A2 y Fmax disminuyeron significativamente para las fracciones de 50–10 y 100–50 kDa, lo que coincide con un mayor grado de inhibición de la agregación α-syn, mientras que el LCR completo y> 100 kDa fueron los más inhibidores (Fig. 4C). Las estimaciones de t2 muestran resultados similares, con LCR completo y> 100 kDa ralentizando significativamente la agregación (Material complementario, figura S6). Estos resultados indican que los principales componentes inhibidores del LCR están enriquecidos en la fracción > 100 kDa, que conserva el mismo efecto inhibidor que el LCR completo. Para identificar las proteínas candidatas responsables de la inhibición de la agregación α-syn, analizamos las muestras derivadas del LCR mediante nLC-nESI HRMS/MS (Fig. 4D). No pudimos detectar cantidades relevantes de proteínas en las fracciones de 10–3 kDa y <3 kDa mediante nLC-nESI HRMS/MS (solo niveles muy bajos de albúmina o fragmentos de albúmina en la fracción de 10-3 kDa, ver Material complementario, Tabla S2 ). En el LCR completo, las más abundantes de las ~ 300 proteínas detectadas fueron la albúmina, la transtiretina (TTR), las apolipoproteínas y la prostaglandina-D sintasa (PGDS, también conocida como proteína traza β). Se encontró que la albúmina y el PGDS no estaban particularmente enriquecidos en la fracción > 100 kDa, lo que sugiere un bajo efecto de inhibición de estas dos proteínas sobre la agregación de α-syn. Tras el efecto inhibidor sobre la agregación de α-syn, las apolipoproteínas fueron más abundantes en el LCR completo y en la fracción > 100 kDa. ApoA1 y ApoE fueron las apolipoproteínas más abundantes en la fracción > 100 kDa (~ 80%), mientras que ApoJ y ApoD representaron ~ 6% cada una. La mayor abundancia de lipoproteínas ricas en ácidos grasos y/u otras proteínas HMW en NPH1 frente a NPH2, y la gran abundancia de lipoproteínas en la fracción más inhibidora del LCR (> 100 kDa) sugieren que estos compuestos en el LCR podrían ser el principal impulsor de la la inhibición de la agregación sembrada y espontánea de α-syn.

Las diferentes fracciones del LCR afectan de manera diferente la agregación α-syn. Un esquema del procedimiento de fraccionamiento del LCR. De una alícuota inicial de 4,5 ml de LCR en PBS 1x, recolectamos 6 alícuotas que contenían compuestos de diferente peso molecular y las congelaron en nitrógeno líquido. Después de cada filtración con filtros centrífugos, el flujo de la fracción filtrada se pasó a un filtro con un límite más pequeño. B La adición de fracciones de LCR, el conjunto completo de NC-CSF y PBS (40 μl) se analizó mediante un ensayo de agregación de proteínas ThT para evaluar los efectos sobre la agregación espontánea de α-syn. La señal de fondo se corrigió restando la fluorescencia promedio de tres réplicas que contenían PBS, LCR completo y fracciones de LCR sin α-syn. Todos los rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan el SEM. C Parámetros A2 ajustados medios (el ajuste no fue posible para muestras con LCR completo y la fracción > 100 kDa) y valores máximos de fluorescencia (Fmax) estimados a partir de trazas de ThT individuales. Se utilizaron dos escalas de intensidad de fluorescencia para comparar mejor los resultados. Los valores representados corresponden al promedio de tres réplicas con barras de error que reflejan el SEM. D Concentración relativa (puntuación emPAI multiplicada por el peso molecular de la proteína) de los constituyentes proteicos más abundantes medidos mediante nLC-nESI HRMS/MS. Las puntuaciones de apolipoproteínas se sumaron, siendo ApoA1 y ApoE las más abundantes (~ 85% del total). No se muestran las puntuaciones de las fracciones 10–3 y < 3 kDa ya que el contenido de proteína de estas fracciones era insignificante con respecto a las demás.

Después de identificar las lipoproteínas como principales candidatas para explicar el efecto inhibidor del LCR sobre la agregación α-syn, evaluamos si el efecto se reproduce cuando se utilizan lipoproteínas purificadas en ausencia de los otros componentes del LCR. Utilizamos lipoproteína de alta densidad (HDL) purificada en suero (LP3, Millipore-Sigma) y albúmina sérica humana purificada en suero (HSA, A1653, Millipore-Sigma) como control. Los niveles de albúmina fueron bastante similares entre las fracciones del LCR, y ya hemos demostrado que la HSA solo reduce parcialmente la agregación de α-syn en concentraciones plasmáticas (43 mg/ml) [16]. Probamos estas proteínas a 0,12 y 0,57 mg/ml para HDL, y a 0,3, 6,7 y 43 mg/ml para HSA (Fig. 5A). Como se esperaba, la agregación espontánea de α-syn en el único tampón presentó un comportamiento doble sigmoideo y alcanzó altos valores de fluorescencia, mientras que HSA presentó un efecto inhibidor marginal incluso en la concentración más alta (niveles plasmáticos). Las concentraciones más bajas no tuvieron un efecto inhibidor sobre la agregación de α-syn. En el caso de HDL, hubo un efecto inhibidor sorprendente sobre la agregación de α-syn. Además, esta inhibición dependía de la dosis ya que hubo un aumento menor en la fluorescencia con HDL de 0,12 mg/ml y una falta total de agregación cuando se usó HDL de 0,57 mg/ml. La evaluación de Fmax y A2 mostró concordancia entre ambos parámetros, excepto para HDL ya que la falta de agregación no permitió el ajuste del modelo doble sigmoideo (Fig. 5B). El análisis de A2/Fmax para concentraciones bajas de HSA no mostró ningún efecto inhibidor sobre la agregación de α-syn (Fig. 5B). Como enfoque complementario/ortogonal, realizamos análisis de transferencia puntual de los productos de reacción utilizando anticuerpos conformacionales A11 y OC que detectan agregados oligoméricos amorfos y fibrilares, respectivamente [22]. Como se muestra en la imagen invertida y ajustada a nivel de ventana con anticuerpos OC y A11 (la imagen nativa y el curso temporal de las muestras de α-syn solo están presentes en la figura S7 del material complementario), se formaron agregados de α-syn (muestras 1, 2 y 3) en presencia de todas las concentraciones de HSA analizadas (Fig. 5C). Sin embargo, HDL redujo significativamente la cantidad de agregados de α-syn en concentraciones de 0,12 y 0,57 mg/ml (muestras 4 y 5), lo que confirma el efecto inhibidor de HDL sobre la agregación de α-syn. También evaluamos las reacciones sin α-syn mediante transferencia puntual, para confirmar que las señales de los anticuerpos no eran un artefacto de las proteínas purificadas del suero (muestras 6 a 10). La cuantificación de la señal de transferencia puntual mostró niveles significativamente más bajos de agregados α-syn en reacciones que contienen HDL versus HSA (p <0,001, Fig. 5D).

HDL reduce la agregación α-syn de manera más eficiente que HSA. Un ensayo de agregación de proteínas ThT realizado utilizando 0,7 mg/mL de α-syn recombinante en PBS pH 7,4 en presencia de diferentes concentraciones de HSA (0, 0,3, 6,7 y 43 mg/mL) y HDL (0, 0,12 y 0,57 mg/mL). ml). Para eliminar la fluorescencia de fondo, antes del análisis se restó la fluorescencia promedio de tres réplicas que contenían la misma cantidad de HSA y HDL sin α-syn. Los datos representan la fluorescencia promedio de tres réplicas con barras de error que representan el SEM. Se muestran los parámetros B Fmax y A2 ajustados a partir de trazas individuales y promediados en las tres réplicas. C Imagen invertida y de ventana/nivel ajustado del ensayo de transferencia puntual realizado en los productos de reacción finales de muestras que contienen HSA y HDL. Las transferencias puntuales se sondaron con anticuerpos conformacionales OC (detección de fibrillas) y A11 (detección de oligómeros amorfos). D Densidad integrada ajustada (fondo restado) medida en una región circular de interés (0,35 cm2) que rodea los puntos en relación con las muestras 1 a 5 con barras de error que representan la desviación estándar del ruido de fondo. El nivel de gris promedio es significativamente menor (p < 0,001) para las muestras con HDL con respecto a todas las concentraciones de HSA analizadas aplicando la prueba t de Student de dos colas tanto para anticuerpos OC como para A11.

Después de confirmar que la HDL purificada en concentración plasmática replica la inhibición de la agregación α-syn mostrada por el LCR completo y por la fracción de LCR > 100 kDa, evaluamos si la HDL podía retener el mismo nivel de inhibición cuando se probaba dentro de un rango de concentraciones de 1 a 0,003 mg/mL (incluidos los fisiológicos del LCR humano). Curiosamente, observamos una inhibición parcial dependiente de la dosis de la agregación α-syn al agregar 0,003 y 0,03 mg/ml, mientras que 0,3 y 1 mg/ml bloquearon completamente la formación de especies agregadas reactivas a ThT (Fig. 6A). La inhibición parcial fue más notable como un retraso en el segundo punto de inflexión (t2), aunque también se observó como una reducción en la fluorescencia de la primera meseta (A1) (recuadro de la Fig. 6A). ApoE y ApoA1 representan del 50 al 60% de la apolipoproteína total del LCR, y sus respectivas concentraciones informadas en el LCR son aproximadamente 0,01 mg/ml y 0,004 mg/ml [26]. Considerando 0,03 mg/ml como concentración fisiológica de HDL en el LCR, nuestros resultados muestran que el HDL inhibió parcialmente la agregación de α-syn a una concentración fisiológica y a una concentración diez veces menor. Aunque nuestros experimentos se realizaron con α-syn recombinante altamente purificado y se demostró que otros componentes no forman agregados detectables de ThT, OC o A11, utilizamos WB para detectar α-syn recombinante monomérico como lectura secundaria para este experimento. De acuerdo con las lecturas de ThT, en ausencia de HDL, hubo una disminución en α-syn monomérico en el momento de la primera meseta (48 h) y la mayor parte del monómero se consumió en el momento de la segunda meseta (180 h). (Fig. 6B, Material complementario, Fig. S8A). Sin embargo, detectamos α-syn monomérico en presencia de HDL después de 180 h de la reacción, y la señal del monómero se encontró aumentada al aumentar las concentraciones de HDL (la más alta a 1 mg/mL de HDL y la más baja en ausencia de HDL, Fig. 6C). Sin embargo, vale la pena mencionar que, en presencia de 1 mg/ml de HDL, observamos una banda adicional (alrededor de 150 a 200 kDa) de intensidad mucho menor que la banda de monómero (Material complementario, figura S8B-C), lo que sugiere que altas concentraciones de HDL pueden haber estabilizado algunos oligómeros prefibrilares, impidiendo su conversión en fibrillas. En conjunto, estos resultados muestran que el HDL sérico purificado (en concentraciones fisiológicas y en ausencia del medio del LCR) es un potente inhibidor de la agregación de α-syn, comparable al LCR completo y a la fracción de LCR > 100 kDa.

HDL reduce la agregación de α-syn incluso a niveles fisiológicos (aprox. 0,03 mg/ml) y subfisiológicos del LCR al prevenir la formación de especies oligoméricas/protofibrilares transitorias. Un ensayo de agregación de proteínas realizado utilizando 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS con 0, 0,003, 0,03, 0,3 y 1 mg/ml de HDL en suero humano añadido. Para eliminar la fluorescencia de fondo, antes del análisis se restó la fluorescencia promedio de tres réplicas que contenían las mismas cantidades de HDL sin α-syn. Todos los rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan SEM. B WB monitoreó la presencia de α-syn monomérico (14–18 kDa) en muestras recolectadas en diferentes puntos temporales del proceso de agregación espontánea utilizando el anticuerpo Syn211. La α-syn monomérica disminuye a medida que t aumenta debido a la formación de fibrillas. C De manera similar, se realizó un WB con Syn211 sobre los productos de reacción obtenidos después de 180 h, a diferentes concentraciones de HDL con y sin α-syn

Se ha informado que las HDL del LCR tienen un tamaño intermedio entre las HDL séricas y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) séricas [26,27,28], lo que podría modular el efecto inhibidor de las HDL del LCR. Por lo tanto, también evaluamos el efecto inhibidor del LDL sérico (LP2, Sigma-Aldrich) sobre la agregación de α-syn para controlar la diferencia en MW. También evaluamos la TTR ya que esta proteína mostró variaciones entre las diferentes fracciones del LCR. En las condiciones de agregación de α-syn in vitro del experimento resumido en la Fig. 6, la concentración de HDL por encima de 0,03 mg/ml bloqueó completamente la agregación espontánea de α-syn, impidiendo la observación de las sutilezas del efecto inhibidor. Por lo tanto, duplicamos el tiempo de agitación (a 2 minutos) para aumentar aún más la agregación espontánea de α-syn en PBS. En estas condiciones ligeramente modificadas, observamos agregación de α-syn con 0,3 mg/ml de HDL. Sin embargo, no hubo una fase de elongación significativa ya que la fluorescencia de la primera (A1) y segunda (A2) meseta era baja y muy similar (Fig. 7A), lo que confirma el alto poder inhibidor de HDL sobre la agregación espontánea de α-syn. Utilizando las condiciones del ensayo de agitación de 2 minutos, probamos LDL y TTR en las mismas concentraciones probadas previamente para HDL y evaluamos su efecto inhibidor en función de los parámetros cinéticos extraídos de las trazas de fluorescencia (Fig. 7A-B). Sorprendentemente, la LDL fue un inhibidor más potente de la agregación espontánea de α-syn que la HDL, ya que 0,3 mg/ml de LDL bloquearon completamente la agregación en estas condiciones (baja Fmax/A2 y > 200 h t2). La TTR no inhibió la agregación espontánea de α-syn cuando se probó dentro del rango de concentración fisiológica (0,03 y 0,3 mg/ml) (Fig. 7A-B). Sin embargo, la TTR mostró una inhibición parcial, más notable en Fmax/A2 cuando se probó a 1 mg/mL, que se ha informado que está cerca de la concentración fisiológica plasmática de TTR [29]. Estos resultados sugieren que el tamaño, la densidad o el contenido lipídico de la lipoproteína no son críticos para la inhibición de la agregación de α-syn, aunque estos factores pueden modular el nivel de inhibición de la agregación de α-syn.

HDL y LDL impiden la agregación α-syn de manera más eficiente que TTR. Las lipoproteínas ejercen sus propiedades antiagregación entrelazándose con especies protofibrilares/oligoméricas tempranas. AB Se ajustaron los parámetros cinéticos de un ensayo de agregación de proteínas realizado utilizando 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS con diferentes concentraciones de LDL, HDL y TTR. Antes del análisis se restó la fluorescencia promedio de tres réplicas que contenían las mismas cantidades de LDL, HDL y TTR sin α-syn. Imágenes CH TEM relativas a los productos finales obtenidos usando (CD) α-syn solo (0,7 mg/mL), (E) LDL 0,3 mg/mL solo, (F) HDL 0,3 mg/mL solo y una combinación de ambos α -syn 0,7 mg/ml + LDL 0,3 mg/ml (G) o HDL 0,3 mg/ml (H)

Hemos demostrado la inhibición de lipoproteínas de la agregación de α-syn por ThT, la detección de especies oligoméricas y amorfas mediante anticuerpos conformacionales y la medición de α-syn monomérico por WB, pero estas técnicas no permiten la observación de especies fibrilares de α-syn en el Presencia de lipoproteína. Por lo tanto, utilizamos microscopía electrónica de transmisión (TEM) para evaluar los productos finales de reacciones de agregación que contienen α-syn solo, α-syn con LDL o HDL, y HDL y LDL sin α-syn (Fig. 7C-H). De acuerdo con los rastros de fluorescencia de ThT y los parámetros cinéticos recopilados para estas reacciones, hubo una marcada disminución en la cantidad de fibrillas de α-syn en reacciones con LDL y HDL en comparación con la reacción de α-syn sola. Curiosamente, las pocas fibrillas pequeñas de α-syn observadas estaban entrelazadas con lipoproteínas (Fig. 7G, H), que se pueden ver fácilmente en la reacción de α-syn con HDL (Fig. 7H). Se han observado estructuras similares, aunque con un entrelazamiento menos claro, al incubar conjuntamente α-syn con NC-CSF (material complementario, figura S9).

Para determinar si el efecto inhibidor de las lipoproteínas sobre la agregación espontánea de α-syn también afecta la agregación sembrada de α-syn intrínseca a los SAA, utilizamos un SAA de α-syn de diagnóstico altamente sensible y específico que puede amplificar las semillas de α-syn directamente desde PD/ DLB/MSA LCR sin mostrar agregación espontánea con el LCR de control sano (HC) [9, 19]. Complementamos n = 4 reacciones de PD-CSF y n = 4 HC-CSF SAA que han resultado consistentemente positivas y negativas en el SAA, respectivamente, con diferentes niveles de HDL y LDL. Cada reacción de SAA contiene LCR, por lo que consideramos que contienen 1 vez la concentración fisiológica de estas proteínas en el LCR. Por lo tanto, las reacciones 1X son reacciones puras en LCR, mientras que las reacciones 2X y 5X se complementaron con lipoproteínas purificadas para alcanzar 2 y 5 veces su concentración fisiológica respectiva en LCR (Fig. 8). HDL inhibió parcialmente la amplificación de las semillas PD α-syn y ralentizó la reacción de amplificación. El tiempo para alcanzar el umbral de fluorescencia de 5000 au (TTT) fue ~ 24% más en promedio en la reacción suplementada con 2X HDL (Fig. 8C). Esta inhibición dependía de la dosis, ya que 5X HDL tuvo un mayor impacto en la amplificación de las semillas PD α-syn; ya que el TTT aumentó en ~55% en promedio con respecto a los medidos en muestras netas. Más importante aún, 5X HDL pudo convertir dos muestras de PD-CSF (+) consistentemente positivas (PD34 y PD47) en un resultado no concluyente (?) [19] (Fig. 8D). El LDL siguió un patrón similar al del HDL, provocando un TTT progresivamente más largo al aumentar la concentración de LDL. En 2X LDL, el resultado de SAA cambió de "+" a "?" para una muestra de PD (PD10), mientras que a 5X para dos muestras de PD cambiaron (PD34 y PD62). También evaluamos si el HDL podría causar alguna reacción cruzada e inducir agregación espontánea en muestras de HC; sin embargo, no hubo un aumento relevante en la fluorescencia en las reacciones que contienen HDL o LDL en comparación con la condición de control. El efecto de agregar 2X y 5X HSA y TTR también se probó en una muestra de HC (HC22) y en una muestra de PD (PD47, experimentos resumidos en la Tabla de material complementario S4). De acuerdo con resultados anteriores, HSA y TTR no inhibieron significativamente la amplificación de semillas PD α-syn y no indujeron ninguna agregación espontánea en la muestra de HC.

HDL y LDL modulan significativamente la agregación α-syn en SAA. Se realizaron trazos de SAA representativos de AB en una muestra de LCR pura de PD (PD47) y en una muestra de LCR pura de HC (HC22) (1 × concentración fisiológica) y las mismas muestras enriquecidas con 0,006 mg/ml (2 × concentración fisiológica) y 0,024 mg/ mL (5 × concentración fisiológica) HDL o LDL. En los paneles A y B, respectivamente, se muestran los rastros cinéticos promedio con barras de error que representan el SEM calculado en tres réplicas de pocillos que contienen LCR al que se añade HDL y LDL. CD Valores promedio de tiempo hasta el umbral (TTT) medidos en todas las muestras de PD. El TTT y el SEM promedio se calcularon asumiendo un TTT de 125 h (TTT máximo observado) para las réplicas en las que la agregación no se consideró significativa (Fmax <5000 au). Se aplicó ANOVA unidireccional junto con la prueba post-hoc de Tukey para evaluar la significación estadística de las diferencias relativas observadas de todas las trazas medidas individuales entre HDL/LDL puro, 2 × y HDL/LDL 5 ×. Las diferencias significativas se marcaron con * y *** indica un valor de p < < 0,001. D Resumen del resultado final del SAA para las muestras de PD y HC analizadas. El resultado se clasificó como: positivo (+) cuando 3/3 de las réplicas se determinaron positivas mediante el algoritmo probabilístico, no concluyente (?) cuando 2/3 de las réplicas se determinaron positivas mediante el algoritmo probabilístico y negativo (-) cuando solo 1/3 o 0/3 réplicas fueron determinadas como positivas mediante el algoritmo probabilístico

Para confirmar aún más el papel de las lipoproteínas en la inhibición del LCR dependiente del paciente en la agregación α-syn, agotamos ApoA1 y ApoE de un LCR recién creado (consulte Materiales y métodos, secciones 2.3, 2.11 y figura complementaria S11) mediante inmunoprecipitación. (IP). Luego analizamos la agregación espontánea de α-syn en presencia de LCR inmunodepletado (IP CSF), LCR sometido al procedimiento IP sin anticuerpos (IP CSF sin Ab) y LCR puro (LCR puro) de la misma muestra de LCR agrupada. Los resultados de este experimento se resumen en la Fig. 9. Como se esperaba, el agotamiento de las dos apolipoproteínas del LCR más abundantes (IP CSF) dio como resultado una agregación espontánea de α-syn significativamente más rápida en comparación con IP CSF sin Ab y LCR puro.

Experimentos en LCR inmunodeprimidos de ApoA1 y ApoE. Un ensayo de agregación de proteínas realizado utilizando 0,7 mg/ml de α-syn recombinante en PBS con 40 μL de: LCR sometido a ApoA1 y ApoE IP (IP CSF), LCR sometido a IP sin anticuerpos (IP CSF sin Ab) y LCR puro perteneciente a diferentes alícuotas del mismo grupo NC. Para eliminar la fluorescencia de fondo, antes del análisis se restó la fluorescencia promedio de tres réplicas que contenían la misma mezcla de reacción sin α-syn. Todos los rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan el SEM. B Parámetros ajustados t2 promedio con barras de error que representan el SEM. Los valores de p se calcularon aplicando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey

Por último, medimos los niveles de las dos apolipoproteínas del LCR más abundantes (ApoA1 y ApoE) en n = 31 muestras de LCR NC negativas para SAA. Aunque la albúmina representa la mayoría de las proteínas totales del LCR, también se consideraron las mediciones de proteínas totales, ya que tanto la ApoA1 como la albúmina del LCR derivan de la sangre periférica [30] y esperábamos que sus niveles estuvieran altamente correlacionados. Las muestras de NC CSF se enriqueceron con semillas α-syn (20 fg) y se volvieron a analizar con SAA para analizar posibles correlaciones entre los niveles de estos analitos y los parámetros cinéticos de SAA. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Fig. 10. Después de la adición de 20 fg de semillas α-syn, todas las muestras de NC CSF dieron positivo para SAA. Teniendo en cuenta el hecho de que las variables de tiempo de SAA (TTT y T50) deberían estar teóricamente relacionadas linealmente con el logaritmo de la masa de la semilla α-syn [12], preferimos utilizar los niveles de proteína total transformada en Log2, ApoA1 y ApoE para calcular los coeficientes de correlación y realizar regresiones lineales. Sin embargo, se encontraron resultados similares cuando no se aplicó la transformación logarítmica. Como puede verse en el mapa de calor de correlación presente en la Fig. 10B, la ApoA1 del LCR y la proteína total del LCR estaban altamente correlacionadas. Además, se encontró que ApoA1, ApoE y la proteína total se correlacionaban significativamente con SAA T50 y TTT (r = 0,4–0,5, valor de p ajustado por FDR <0,05). Curiosamente, la suma transformada en Log2 de ApoA1 y ApoE fue la variable que mostró la mayor correlación con T50 (r = 0,55) y TTT (r = 0,62), lo que es consistente con el hecho de que las lipoproteínas en general pueden modular la agregación α-syn en SAA. .

ApoA1, ApoE y el contenido de proteína total del LCR se correlacionan significativamente con las variables de tiempo de SAA. Un trazo de fluorescencia representativo de SAA ThT en relación con las muestras que producen el TTT más corto (NC1, TTT = 12,8 h), mediano (NC2, TTT = 15,8 h) y más largo (NC3, TTT = 20,3 h) promediado en tres réplicas. Todos los rastros de fluorescencia de ThT se representan como intensidad promedio en 3 réplicas con barras de error que representan el SEM. B Mapa de calor que resume las correlaciones (de Pearson) entre los parámetros cinéticos de SAA y ApoA1, ApoE, ApoA1 + ApoE y proteína total del LCR transformados con Log2. La agrupación jerárquica se realizó utilizando el criterio de vinculación de Ward. Gráficos de dispersión de CF con detalle de los coeficientes de correlación de Pearson y el valor p relativo para TTT frente a concentraciones de LCR transformadas con Log2 (originalmente en μg/mL) de ApoA1 (C), ApoE (D), proteína total (E) y ApoA1 + ApoE (F). También se muestran las líneas de regresión lineal con sus intervalos de confianza del 95% (líneas de puntos)

En la literatura reciente se ha informado brevemente sobre la inhibición de la fibrilización espontánea y sembrada de α-syn por el LCR humano, pero aún no se ha caracterizado [1, 11, 12, 13]. Dada la posible interferencia de la inhibición relacionada con el LCR en los SAA de diagnóstico, estudiamos este fenómeno mediante un enfoque de múltiples técnicas, que incluye nLC-nESI HRMS/MS, dot-blot, ELISA, IP, WB, TEM, RMN en solución, una solución altamente precisa. y SAA de diagnóstico estandarizado, y diferentes condiciones de agregación in vitro para evaluar la agregación espontánea de α-syn. Primero supimos que el efecto inhibidor del LCR depende del donante, lo que añadió una nueva capa de complejidad a esta cuestión. Utilizando condiciones de agregación α-syn que exacerbaron el efecto inhibidor del LCR en la agregación espontánea y sembrada a pH fisiológico y fuerza iónica, encontramos una diferencia dramática en el efecto inhibidor del LCR en dos casos de NPH. Los estudios de RMN y EM mostraron que la muestra de NPH más inhibidora presentaba niveles más altos de proteínas y lipoproteínas. Después de fraccionar un conjunto de LCR NC humano usando filtros MWCO, confirmamos que los componentes de HMW (> 100 kDa) conservaban el mismo efecto inhibidor sobre la agregación de α-syn que el LCR completo, mientras que las fracciones de MW más pequeñas eran menos inhibidoras. Se debe considerar que la distribución del tamaño de poro de los filtros MWCO permite que un bajo porcentaje de componentes HMW pase a través del filtro en fracciones MW más pequeñas. Esta posible fuga de material HMW en fracciones de PM más bajo podría explicar el efecto inhibidor más bajo, pero aún detectable, observado en esas fracciones. Usando MS identificamos albúmina, TTR, PGDS y apolipoproteínas como los componentes HMW más abundantes en el conjunto NC CSF utilizado. La distribución de la apolipoproteína en las fracciones del LCR se correlacionó con la inhibición de cada fracción en la agregación α-syn, mientras que la albúmina, la TTR y la PGDS no. Las apolipoproteínas, particularmente ApoA1 (28,3 kDa) y ApoE (34 kDa), fueron las más representadas en la fracción > 100 kDa. Dado el PM, lo más probable es que estas apolipoproteínas se ensamblaran en lipoproteínas en el LCR. Luego confirmamos que las HDL purificadas en suero en ausencia de un medio de LCR podían inhibir la agregación espontánea de α-syn. Además, se observó una inhibición parcial al evaluar el HDL en concentraciones subfisiológicas en el LCR. Estos hallazgos se confirmaron mediante el seguimiento de la agregación mediante transferencia puntual con dos anticuerpos conformacionales diferentes y la detección por WB del α-syn monomérico que no se convirtió en fibrillas en la reacción de agregación. En estos experimentos, aunque la mayoría de los α-syn permanecieron monoméricos a 1 mg/ml de HDL, pudimos detectar la presencia de una banda a 150-200 kDa, lo que sugiere que las altas concentraciones de HDL podrían haber estabilizado algunos oligómeros prefibrilares, impidiendo su conversión en fibrillas. Dado que las HDL en LCR son más grandes que las HDL en sangre y más pequeñas que las LDL en sangre [27, 28], también evaluamos el efecto inhibidor de las LDL purificadas en suero sobre la agregación α-syn y observamos un efecto inhibidor similar o mayor que con las HDL incluso a concentraciones subfisiológicas. Evaluamos HDL y LDL en las mismas concentraciones en términos de mg/mL, pero debido al menor peso molecular de HDL, la concentración molar de HDL fue mayor que la concentración de LDL en nuestros experimentos de agregación α-syn. Por lo tanto, el mayor efecto inhibidor del LDL podría indicar que la inhibición está impulsada por la fracción lipídica del complejo, aunque hay muchos informes que muestran que los lípidos promueven la agregación de α-syn [31].

Utilizamos TEM para observar la ultraestructura de las fibrillas α-syn en presencia de HDL y LDL y encontramos que ambas lipoproteínas se colocalizan con las fibrillas, lo que sugiere una interacción directa con los agregados α-syn. Aunque la solución de RMN ha demostrado previamente ser una herramienta adecuada para identificar proteínas que interactúan con α-syn monomérico [16, 32], no pudimos encontrar ninguna evidencia de interacciones entre HDL o LDL con α-syn monomérico recombinante. La hipótesis de una interacción entre HDL y especies oligoméricas o prefibrilares sería compatible con esos resultados. Las condiciones de agregación α-syn en PBS mostraron un comportamiento doble sigmoidal peculiar. El análisis TEM encontró que la primera meseta estaba enriquecida en especies prefibrilares/oligoméricas y la segunda meseta enriquecida en fibrillas, lo que también se ha informado para otras proteínas amiloidogénicas [33]. HDL redujo principalmente la formación de especies oligoméricas/protofibrilares en la primera meseta, lo que ralentizó o bloqueó por completo la formación posterior de fibrillas α-syn de una manera dependiente de la dosis a partir de concentraciones subfisiológicas. Por el contrario, el agotamiento de las dos apolipoproteínas del LCR más abundantes (ApoA1 y ApoE) del LCR dio como resultado una agregación espontánea más rápida de α-syn en PBS. En general, estos resultados son consistentes con un efecto inhibidor sobre la formación de especies oligoméricas ejercido por las lipoproteínas del LCR, especialmente en la fase de retraso antes de la primera meseta.

Luego evaluamos el efecto de las lipoproteínas en la amplificación de semillas α-syn de muestras de LCR de PD humana en un SAA ultrasensible. En estos experimentos, las reacciones se complementaron con HDL y LDL para imitar muestras de LCR con 2 o 5 veces los niveles fisiológicos de HDL y LDL. Descubrimos que tanto HDL como LDL podrían cambiar significativamente los parámetros cinéticos de la reacción de amplificación a partir de una concentración 2X. Con una concentración de 2X LDL, el resultado de SAA de una de las cuatro muestras de PD cambió de positivo a no concluyente, mientras que lo mismo ocurrió con dos de cuatro muestras de PD con 5X HDL y LDL. Sin embargo, la probabilidad de encontrar muestras de LCR que contengan niveles tan altos de lipoproteínas es baja, lo que concuerda con la impresionante sensibilidad y especificidad reportadas consistentemente por los AAS de diagnóstico [4]. Sin embargo, la concentración de todas las lipoproteínas combinadas, además de otros componentes inhibidores menores del LCR, podría explicar el 5% de los casos de EP/DLB confirmados clínica y patológicamente que suelen ser negativos cuando se prueban con SAA. También demostramos que, en una pequeña cohorte de muestras de LCR de NC enriquecidas con 20 fg de semillas α-syn, SAA T50 y TTT se correlacionaron significativamente con los niveles de ApoA1 y ApoE en el LCR y aún más con su suma. Además, se encontró que la proteína total del LCR, una medición que está fácilmente disponible para la mayoría de los pacientes que se someten a un análisis del LCR para un estudio diagnóstico, está fuertemente correlacionada con los niveles de ApoA1 en el LCR y moderadamente con los parámetros cinéticos de T50 y TTT. Nuestros resultados confirman que la cinética de la amplificación de las semillas α-syn no es sólo una función de la masa de las semillas α-syn o de la “cepa” α-syn, sino también de la composición general del LCR y, en particular, de la concentración de lipoproteínas. /apolipoproteínas. Nuestros hallazgos pueden tener profundas implicaciones para el uso de parámetros cinéticos en ensayos de SAA para predecir el estado de la enfermedad, la progresión de la enfermedad y el pronóstico de la enfermedad, ya que demostramos que el efecto inhibidor del LCR depende del donante. Aún se desconoce si la progresión de la enfermedad se correlaciona con la cantidad de semillas en una muestra de LCR, pero si lo hace, la estimación de los niveles de semillas α-syn mediante parámetros cinéticos necesitará modelos para controlar los componentes del LCR, como las apolipoproteínas o la proteína total, como medida sustituta. . De hecho, en ausencia de efectos de matriz, TTT y T50 deberían asociarse linealmente con el logaritmo de la masa α-syn agregada [12]. La adición del contenido de lipoproteínas del LCR/proteína total como covariable puede restaurar esta relación lineal, permitiendo así la cuantificación de la masa α-syn agregada. Además de nuestros resultados, ya se ha demostrado que las especies α-syn y las lipoproteínas interactúan mediante coinmunoprecipitación tanto en plasma [34] como en LCR [35]. Dado que los niveles de apolipoproteína y el genotipo se han documentado previamente como relevantes en la EP [36, 37] y que, en nuestros experimentos, las lipoproteínas inhibieron la agregación de α-syn in vitro en concentraciones subfisiológicas, la interacción entre α-syn y las lipoproteínas podría ser biológicamente relevante y merece una mayor investigación.

Nuestros resultados describen una nueva interacción entre las lipoproteínas y α-syn que inhibe la formación de fibrillas de α-syn y podría tener implicaciones biológicas relevantes in vivo. Nuestros hallazgos también tienen implicaciones directas e importantes para el futuro desarrollo y mejora de los α-syn SAA, que actualmente son la herramienta de diagnóstico más prometedora para las sinucleinopatías. La inhibición específica del donante del LCR en la agregación α-syn informada aquí ofrece una explicación para la falta de correlación observada entre los parámetros cinéticos y la progresión clínica. Además, nuestros datos revelan que la apolipoproteína es el principal componente inhibidor del LCR, lo que sugiere que las mediciones de apolipoproteínas y/o del contenido de proteína total podrían incorporarse en los modelos de análisis de datos para eliminar los efectos de confusión del entorno del LCR en los esfuerzos de cuantificación de semillas de α-syn utilizando parámetros cinéticos.

Todos los datos relevantes generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Los datos brutos de fluorescencia y espectrometría de masas están disponibles para los autores correspondientes previa solicitud razonable.

Coeficiente de variación

Demencia con cuerpos de Lewy

Ácido etilendiaminotetraacético

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

PAI exponencialmente modificado

Tasa de falso descubrimiento

Fluorescencia máxima

Fluorescencia mínima

Control saludable

Lipoproteína de alta densidad

Alto peso molecular

Albúmina sérica humana

Correlación cuántica única heteronuclear

Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados.

Inmunoprecipitación

Isopropil-β-D-1-tiogalatopiranósido

Luria–Agricultura

Lipoproteínas de baja densidad

Atrofia multisistémica

Peso molecular

Corte de peso molecular

Controles neurológicos

Nanocromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución equipada con una interfaz de nanoelectrospray

Resonancia magnética nuclear

Hidrocefalia normotensiva

Densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm.

Solución salina tamponada con fosfato

enfermedad de Parkinson

Prostaglandina-D sintasa

Piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanosulfónico)

Amplificación cíclica de plegamiento incorrecto de proteínas

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

Fluoruro de polivinilideno

Unidades de fluorescencia relativas

Region de interes

Conversión inducida por temblores en tiempo real

Ensayo de amplificación de semillas.

Dodecilsulfato de sodio: electroforesis en gel de poliacrilamida

Error estandar de la media

Es hora de llegar a la mitad del máximo

Microscopio de transmisión por electrones

Tioflavina-T

transtiretina

mancha occidental

α-sinucleína

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Agradecemos a la Dra. Maya Petricciuolo por el apoyo brindado durante la preparación de las grillas TEM. También agradecemos a los revisores anónimos por sus críticas y sugerencias constructivas.

GB cuenta con el apoyo de la beca posdoctoral para científicos básicos de la Fundación Parkinson (ID del premio: PF-PRF-934916). SP está financiado por la subvención AGYR2020 de la Associazione Italiana Ricerca Alzheimer Onlus (Airalzh). Este trabajo fue apoyado parcialmente por el Ministerio de Salud italiano (RRC) para FM. Este trabajo también contó con el apoyo de la Regione Toscana (CERM-TT y BioEnable), el Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca de Italia a través del “Progetto Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 (DICUS 2.0)” para el Departamento de Química “ Ugo Schiff” de la Universidad de Florencia, y el laboratorio de Proteínas Recombinantes JOYNLAB. Los autores agradecen el apoyo y el uso de recursos de Instruct-ERIC, un proyecto histórico de ESFRI, y específicamente el centro CERM/CIRMMP Italia, así como el proyecto “Potenciando la capacidad italiana para servicios de biología estructural en Instruct-ERIC, acrónimo” ITACA.SB” (Proyecto no. IR0000009) dentro de la convocatoria MUR 3264/2021 PNRR M4/C2/L3.1.1, financiada por la Unión Europea – NextGenerationEU. ALW cuenta con el apoyo del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 86019 – proyecto MIRIADE (programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea).

Laboratorio de Neuroquímica Clínica, Sección de Neurología, Departamento de Medicina y Cirugía, Universidad de Perugia, Piazzale Lucio Severi 1/8, 06132, Perugia, Italia

Giovanni Bellomo, Silvia Paciotti, Anna Lidia Wojdaƚa, Marta Filidei y Lucilla Parnetti

Unidad de I+D, Amprion Inc, 11095 Flintcote Av., San Diego, San Diego, CA, 92121, EE. UU.

Luis Concha-Marambio, Yihua Ma & Carly M. Farris

Centro de Resonancia Magnética (CERM), Universidad de Florencia, Via Luigi Sacconi 6, 50019, Sesto Fiorentino, Italia

Domenico Rizzo, Linda Cerofolini, Stefano Giuntini, Sara Bolonia, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai y Claudio Luchinat

Departamento de Química “Ugo Schiff”, Universidad de Florencia, Via Della Lastruccia 3, 50019, Sesto Fiorentino, Italia

Domenico Rizzo, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai y Claudio Luchinat

Sección de Fisiología y Bioquímica, Departamento de Medicina y Cirugía, Universidad de Perugia, Piazzale Lucio Severi 1/8, 06132, PerugiaPerugia, Italia

Davide Chiasserini y Leonardo Gatticchi

Consorcio Interuniversitario de Resonancias Magnéticas de Proteínas Metálicas (CIRMMP), Via Luigi Sacconi 6, 50019, Sesto Fiorentino, Italia

Linda Cerofolini, Enrico Ravera, Moreno Lelli, Marco Fragai y Claudio Luchinat

División de Neurología 5 y Neuropatología, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, Via Celoria 11, 20133, Milán, Italia

Chiara María Giulia De Luca & Fabio Moda

Departamento de Ciencias de la Salud, Centro de Espectrometría de Masas CISM, Universidad de Florencia, Viale Gaetano Pieraccini 6, 50139, Florencia, Italia

Giuseppe Pieraccini

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GB, CL y M.Fr. diseñó la investigación; GB, SP, LG, DR realizaron los ensayos de agregación de proteínas para caracterizar la interacción entre α-syn y LCR; LCM, YM y CMF planificaron y realizaron los experimentos de amplificación de semillas ultrasensibles en Amprion. DR y SB expresaron y purificaron α-sinucleína recombinante; DR y SG expresaron y purificaron transtiretina recombinante; GB, LC, DR y ML realizaron experimentos de RMN en solución; SG, DR y SP realizaron la combinación y el fraccionamiento del LCR; LG y SP realizaron experimentos de transferencia puntual y transferencia Western; GP realizó los análisis de espectrometría de masas; FM y CMGDL realizaron las mediciones de microscopía electrónica de transmisión; ALW, DC y GB realizaron inmunoprecipitación del LCR, experimentos de transferencia Western, contenido de proteína total y mediciones ELISA ApoA1 y ApoE; M.Fr., CL y LP proporcionaron los reactivos y herramientas analíticas necesarios; GB, ER y M.Fi. realizó la búsqueda bibliográfica; CL, LP, M.Fr. y ML supervisó el proyecto; GB analizó los datos y escribió el primer borrador; ER, YM y CMF, idioma y gramática inglesa revisados; Todos los autores revisaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Giovanni Bellomo o Claudio Luchinat.

Todos los procedimientos con seres humanos se realizaron siguiendo la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes y/o sus representantes legales dieron su consentimiento informado por escrito para la punción lumbar, recolección de LCR, evaluación, análisis e inclusión en el estudio, que fue aprobado por el Comité de Ética local (CEAS n. 1287/08) de la Universidad de Perugia. . Las muestras de LCR se obtuvieron con el consentimiento informado de todos los participantes.

No aplica.

Los autores declaran los siguientes intereses financieros en competencia: El Prof. Parnetti se desempeñó como miembro de los consejos asesores de Fujirebio, IBL, Roche y Merck. La Dra. Concha, la Sra. Farris y el Sr. Ma son inventores de varias patentes relacionadas con la tecnología SAA (PMCA) y están asociados a Amprion Inc., una empresa de biotecnología centrada en la utilización comercial de SAA para diagnóstico. Todos los demás autores declaran que no existen intereses financieros y no financieros en competencia.

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Figura S1. Tinción con plata en α-syn utilizada en experimentos de agregación de proteínas. Se realizaron dos experimentos de tinción con plata replicados en un gel SDS-PAGE al 4-20% con 1 μg de α-syn purificado después de uno (carril 3) y dos (carril 2) pasos de cromatografía de exclusión por tamaño. Figura S2. T50 medida en seis muestras diferentes de LCR humano enriquecidas con 20 fg de semillas. Los parámetros T50 medidos fueron globalmente diferentes, según lo evaluado mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba post-hoc LSD de Fisher para comparaciones de medias. *0,01 fracción de LCR de 100 kDa en PBS. Los residuos que experimentan las mayores disminuciones en la intensidad de la señal (menores en una o más desviaciones estándar con respecto al valor promedio) se resaltan en azul claro. Los ratios de intensidad correspondientes a los picos superpuestos están resaltados en rojo (sus valores no fueron considerados en el cálculo de las disminuciones promedio y las desviaciones estándar). Figura S5. Deriva del pH del LCR. El cambio de pH debido a la exposición del LCR al aire se monitorizó a lo largo del tiempo en 500 µL de LCR combinado sin diluir (A) y en presencia de PBS (400 µL de LCR + 200 µL de PBS 3x) en viales de polipropileno con un medidor de pH Thermo Scientific Orion. -Medidor equipado con un microelectrodo pHenomenal MIC 220 de vidrio de 6 mm de diámetro. Justo antes de cada medición, la muestra se agitó durante 20 segundos y se dejó abierta al aire durante otros 20 segundos. Figura S6. Las diferentes fracciones del LCR afectan de manera diferente la agregación α-syn. Parámetros t2 ajustados medios de muestras con 40 µl de fracciones de PBS/CSF. Los valores mostrados resultan del promedio de tres réplicas con barras de error que reflejan el SEM. Para el LCR completo y la fracción >100 kDa, se muestra la duración total del experimento debido a la ausencia de agregación apreciable. Figura S7. Imágenes sin procesar de los ensayos dot-blot. AB) Imágenes nativas del ensayo de transferencia puntual realizado en replicaciones de α-syn solo en diferentes momentos con anticuerpos conformacionales OC (A) y A11 (B). CD) Imagen nativa del ensayo de transferencia puntual realizado en muestras que contienen HSA y HDL con anticuerpos conformacionales OC (C) y A11 (D). Figura S8. Experimentos de WB para rastrear la agregación de α-syn en presencia de HDL humana. A) Los patrones de agregación de α-Syn en muestras recolectadas en diferentes puntos temporales del proceso de agregación espontánea fueron monitoreados por WB usando el anticuerpo Syn211 (SDS-PAGE al 4-20 %, 2 μg de proteína cargada). La α-syn monomérica disminuye a medida que t aumenta debido a la formación de fibrillas. B) De manera similar, se realizó un WB con Syn211 sobre los productos de reacción obtenidos después de 180 h, a diferentes concentraciones de HDL con y sin α-syn (tiempo de exposición 210 s). C) Luego se repitió el experimento duplicando la cantidad de muestra cargada en el gel para resaltar mejor la presencia de especies oligoméricas (tiempo de exposición 30 s). En estas condiciones, elegidas para visualizar mejor la señal a 150-200 kDa, las bandas de monómero α-syn a 1 y 0,3 mg/ml de HDL pueden no reflejar cuantitativamente la concentración de monómero (carriles sobrecargados). Figura S9. Imágenes TEM representativas de α-syn incubadas con LCR. Imágenes TEM representativas obtenidas analizando muestras obtenidas mediante la coincubación de α-syn 0,7 mg/ml a 37 °C con LCR humano combinado (relación 1:5 con respecto al volumen total de reacción). Las muestras se sometieron a ciclos de incubación (13 min) y agitación (doble orbital, 2 min) a 500 rpm. Figura S10. Titulaciones de RMN de α-syn con HDL, LDL y TTR. A) Disminuciones de intensidad de las señales de experimentos bidimensionales (2D) 15N-1H HSQC adquiridos a 950 MHz a T = 283 K en α-syn marcado con 15N (100 μM) en PBS después de la adición de 0,57 mg/ml de suero. HDL derivada. Las relaciones de intensidad correspondientes a los picos superpuestos se resaltan en rojo. B) Disminuciones de intensidad de las señales de experimentos HSQC 15N-1H bidimensionales (2D) adquiridos a 950 MHz a T = 283 K en α-syn marcado con 15N (100 μM) en PBS después de la adición de 1 mg/ml de suero. LDL derivada. C) Disminuciones de intensidad de las señales de experimentos bidimensionales (2D) 15N-1H HSQC adquiridos a 950 MHz a T = 283 K en α-syn marcado con 15N (100 μM) en PBS después de la adición de 3 mg/ml de TTR. Figura S11. Experimentos de WB realizados en LCR inmunodeprimido. Se realizaron experimentos de WB con anticuerpos anti-ApoA1 (MIA1404) y anti-ApoE (PA5-27088) en LCR puro y sobrenadantes (400 μL de LCR, 100 μL de suspensión) resultantes del procedimiento de inmunoprecipitación realizado utilizando diferentes cantidades de los mismos anticuerpos (IP CSF muestras), inmunoprecipitación realizada sin anticuerpos (CSF IP no Ab). Luego se seleccionaron las condiciones relativas a IP CSF ApoA1 60 µg y IP CSF ApoE 20 µg para los ensayos de agregación de proteínas. Tabla S1. Factores de concentración y volúmenes finales de las fracciones del LCR.

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Reimpresiones y permisos

Bellomo, G., Paciotti, S., Concha-Marambio, L. et al. Las lipoproteínas del líquido cefalorraquídeo inhiben la agregación de α-sinucleína al interactuar con especies oligoméricas en ensayos de amplificación de semillas. Mol Neurodegeneración 18, 20 (2023). https://doi.org/10.1186/s13024-023-00613-8

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Recibido: 26 de agosto de 2022

Aceptado: 12 de marzo de 2023

Publicado: 01 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00613-8

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